La vacuna contra les partícules semblants al virus i el seu procés de purificació aigües avall
La vacuna de partícules similars a virus (VLP) és una tecnologia de vacuna que es basa en l'estructura del virus, però que no conté els materials genètics virals. Estimulen una resposta immune forta imitant la morfologia i els antígens superficials dels virus naturals i proporcionen una major seguretat a causa de la seva incapacitat de replicar. Les vacunes VLP són una millor alternativa a les vacunes tradicionals (atenuades i inactivades en viu). La vacuna contra la VLP no es pot replicar al cos, per la qual cosa és adequat per a tothom, incloses les dones embarassades o per a aquelles persones amb sistemes immunitaris compromesos. A més, les proteïnes de la càpsida (incloses altres proteïnes estructurals) de virus amb genomes segmentats, com ara virus de la grip, virus de malaltia africana del cavall i virus de bluetgongue, també es poden utilitzar per desenvolupar vacunes contra VLP sense preocupar -se de problemes de recombinació genètica com les vacunes vives atenuades. En segon lloc, els VLP són capaços de imitar l'estructura de virus reals, a diferència de les vacunes inactivades, les proteïnes estructurals de les quals es poden modificar durant la inactivació, donant lloc a un deteriorament immunogènic.
Fig. 1. Mecanisme de formació de VLP i VLPs quimèrics
Característiques de la vacuna VLP
1. Estructura similar als virus naturals: els VLPs estan muntats per una o més proteïnes estructurals virals (com les proteïnes de la càpsida), i la seva mida i forma són similars als virus reals.
2. No-infecciós: no conté el genoma viral, no pot replicar ni causar malalties.
3. Alta immunogenicitat: l'estructura granular es pot reconèixer de manera eficient pel sistema immune i activar les respostes de cèl·lules B i cèl·lules T. Pot induir anticossos neutralitzadors i immunitat cel·lular (per exemple, VIH, vacunes contra el VPH).
4. Alta seguretat: adequat per a persones amb baixa funció immune (com la vacuna contra l’hepatitis B VLP).
Fig. 2. VALLS VLP disponibles
Sistema de producció de vacunes VLP
Els VLP es poden produir mitjançant diversos sistemes d’expressió, les plataformes comunes inclouen:
1. Sistema de cel·les d’insectes: sistema:
Avantatges: rendiment elevat, baix cost, adequat per al conjunt de proteïnes complexes.
Aplicació: vacuna contra el VPH, vacuna contra l’Ebola.
2. Cèl·lules de mamífers (per exemple, cèl·lules HEK293):
Avantatges: les modificacions post-translacionals són més properes als humans i adequats per a VLP envoltats (com ara les vacunes contra la grip).
3. Sistemes de llevats (per exemple, Pichia pastoris):
Avantatges: S'ha utilitzat ràpid i baix cost en la vacuna contra l'hepatitis B.
4. Sistemes de plantes (per exemple, cloroplasts de tabac):
Respectuós amb el medi ambient i escalable, en desenvolupament (per exemple, vacuna contra Norovirus VLP).
Procés de purificació aigües avall de la vacuna VLP
La diversitat de sistemes d’expressió VLPS condueix a la inuniversitat dels processos de purificació aigües avall.
Fig. 3 Un quadre de flux de processos generals generals
Collita i aclariments:
En tot tipus de medi de cultiu, que es propDuça per la cultura cel·lular, hi ha un gran nombre de partícules de virus, així com moltes deixalles de teixits cel·lulars, productes metabòlics i altres impureses, fent que el cultiu sigui ennuvolat o semi-amargant, si la concentració del medi de cultiu directament, la membrana d’ultrafiltració es bloquejarà, resulta que la concentració no es pot completar i la membrana d’ultrafiltració es fa un rascat. Per tant, s’ha d’aclarir primer abans de la concentració, per eliminar les partícules grans del medi de cultiu, de manera que es converteixi en una solució translúcida o transparent, i la concentració del medi de cultiu pot fer que el procés de concentració sigui normal i assegurar la vida útil de la membrana d’ultrafiltració. L’aclariment abans de la concentració de la solució de cultiu és un enllaç tècnic clau en el procés de concentració.
Un procés d’aclariment eficient requereix una combinació d’alta capacitat per eliminar les partícules sòlides, el rendiment de producte elevat, l’ampliació fàcil i la protecció a les unitats de funcionament aigües avall.
Mètode
Centrifugació: La centrifugació diferencial elimina partícules grans.
Filtració profunda: utilitzeu un filtre de multistaget (per exemple, 1,2μm → 0. 45μm) per aclarir el sobrenedant.
Filtració de flux tangencial (TFF): adequat per a la producció massiva, concentra mostres i elimina petites partícules d’impureses.
Tanmateix, si l’escala de cultiu és massa gran, la centrifugació triga molt, es requerirà un gran nombre de membranes de filtre profund, de manera que el cost dels consumibles augmenta molt. Al mateix temps, l’elevada densitat de cultiu cel·lular reduirà la càrrega de la membrana del filtre profund, donant lloc a un augment de costos i una dilució excessiva del producte.
Hi ha dos tipus de components de membrana TFF: casset pla i fibra buida. La filtració de flux tangencial (TFF) és impulsada per la diferència de pressió transmembrana. Les substàncies i les impureses que són menors que el porus de la membrana passen per la membrana, mentre que les impureses com les cèl·lules amb partícules més grans estan atrapades. La mida dels porus de la membrana utilitzada per a la microfiltració és {{{2 {2}}}. 45/0,22μm. La fibra buida pot processar directament el líquid de contingut sòlid elevat, com ara el medi de cultiu cel·lular d’alta densitat, pot eliminar els passos de centrifugació i pre-filtració, menys passos, operació senzilla, membrana es pot utilitzar repetidament mitjançant la neteja, reduint els costos d’inversió dels equips i els costos de funcionament, d’acord amb els requisits de producció automatitzada modular.
Concentració d’ultrafiltració (TFF):
Objectiu: Per reduir la quantitat de tractament cromatogràfic, millorar l’eficiència cromatogràfica i protegir la columna cromatogràfica.
En general, la ultrafiltració (TFF) es pot concentrar més de 100 vegades de VLP i la taxa d’eliminació de l’heteroproteïna pot arribar al 99%. Entre ells, la tecnologia de filtració de membrana de fibra buida té els avantatges de la força de cisalla lleu i baixa, no és fàcil de connectar, funcionament flexible, vida llarga, baix cost i fàcil amplificació, per la qual cosa es recomana triar fibra buida per a VLP concentrada i purificada.
Quan el mètode d’ultrafiltració s’utilitza per a la concentració i la purificació, és molt important seleccionar la mida del porus de la membrana adequada, que determina directament l’eficiència i la qualitat de la concentració. D’una banda, és necessari seleccionar l’obertura de la membrana per atrapar eficaçment les molècules objectiu per assegurar el rendiment i, d’altra banda, s’hauria de tenir en compte l’efecte d’eliminació i la velocitat de processament de les heteroproteïnes. Per tant, el millor principi és seleccionar la membrana amb la mida de porus més gran que pot atrapar la molècula objectiu i intentar seleccionar la membrana del filtre amb una distribució uniforme de mida de porus.
Purificació primària:
1. Mètode de precipitació
Precipitació de polietilenglicol (PEG): la precipitació selectiva de VLP requereix concentració de PEG optimitzada i concentració de sal per equilibrar el rendiment i la puresa.
2. Cromatografia
Cromatografia per afinitat:
Afinitat de l’heparina: utilitzant les propietats VLPS de càrrega negativa superficial (per exemple, VLP HPV).
Cromatografia d’acoblament d’anticossos: alta especificitat però costosa.
Cromatografia d’intercanvi d’ions (IEX): Trieu l’intercanvi d’anions (per exemple, la columna Q) o l’intercanvi de cations (per exemple, la columna SP) depenent de les característiques de càrrega de la superfície VLP i optimitzeu el gradient de pH i sal per evitar l’agregació de partícules.
Cromatografia d'interacció hidrofòbica (HIC): basada en la hidrofobicitat superficial de VLPS, adequada per a alguns VLP no encapsulats.
Purificació fina:
Cromatografia d’exclusió molecular (Sec, filtració de gel):
Eliminació de proteïnes hostes residuals, àcids nucleics o agregats, acompanyats de reemplaçament tampó. Flux d’alta resolució però baix, sovint utilitzat com a pas final de perfeccionament.
Cromatografia en diversos models:
Per exemple, les resines de sèries de capto nucli, combinades amb l’intercanvi d’ions i l’efecte tamís molecular, poden eliminar una varietat d’impureses en un sol pas.
Inactivació del virus/Eliminació d’àcids nucleics (si es requereix):
Tractaments de nucleasa: com la benzonasa degraden l'ADN/ARN hoste.
UF/DF: coordinació del sistema TFF per eliminar petits fragments d’àcids i enzims nucleics.
Concentració i preparació:
Filtració de flux tangencial (TFF):
Concentrar -se per orientar els títols mentre desplaça els buffers (com ara PBS o buffers de formulació).
Filtració estèril:
0. 22μm La filtració de membrana garanteix l'esterilitat.
Cas típic
A continuació es mostren els processos de purificació aigües avall per a les vacunes típiques de VLP.
Sobre orientació
La tecnologia d’orientació és una empresa orientada a la producció i d’alta tecnologia centrada en l’aclariment, la separació i la purificació de les biofarmacèutiques. Els productes s’utilitzen àmpliament en el procés de filtració de mAb, vacuna, diagnòstic, productes sanguinis, sèrum, endotoxina i altres productes biològics; La tecnologia d’orientació té “dispositiu de filtració de fluxos tangencials”, “membrana de fibra buida”, “filtre de virus”, “membrana profunda”, “filtre d’esterilització”, “dispositius de filtre centrífuga” i altres productes i té un gran nombre de línies de productes, des de petites filtracions de laboratori disposibles al sistema de filtració de producció, satisfan les necessitats de les proves i la producció. La tecnologia d’orientació té ganes de cooperar amb vosaltres.