Procés de purificació aigües avall a escala industrial-per a la vacuna contra la rinotraqueïtis infecciosa bovina (IBR) — Secció "Ultrafiltració"
La rinotraqueïtis infecciosa bovina (IBR) és causada per la infecció amb el virus de la rinotraqueïtis infecciosa bovina (IBRV), també conegut com a herpesvirus boví tipus 1 (BHV-1). La malaltia es caracteritza principalment per símptomes respiratoris i avortament. A més d'aquestes manifestacions clíniques, l'IBR pot provocar una reducció del rendiment de llet en el bestiar lleter i una disminució de l'augment de pes en el bestiar boví, la qual cosa comporta pèrdues econòmiques importants per a les explotacions ramaderes.
La malaltia és de naturalesa immunosupressora. Quan es produeix com una sola infecció, la seva patogenicitat és relativament baixa; tanmateix, quan es produeixen infeccions mixtes amb altres malalties víriques o bacterianes, la gravetat i el dany augmenten significativament. La vacunació és el mètode més eficaç per a la prevenció i el control, amb dos tipus principals de vacunes disponibles: les vacunes vives atenuades i les vacunes inactivades. Actualment, les vacunes contra la rinotraqueitis infecciosa bovina que s'utilitzen a les granges són vacunes predominantment inactivades.
Les vacunes vives atenuades es caracteritzen per una forta immunogenicitat, una ràpida aparició de la immunitat i una llarga durada de la protecció (generalment més de sis mesos). S'utilitzen habitualment per a la immunització d'emergència durant els brots de malalties. Tanmateix, comporten riscos potencials de propagació del virus, representen riscos per a les vaques embarassades i no es poden utilitzar en bestiar infectat latentment però asimptomàtic.
Les vacunes inactivades es caracteritzen per una alta seguretat, sense risc de propagació del virus o de reversió a la virulència, i es consideren absolutament segures. Es poden utilitzar en bestiar boví en totes les etapes, incloses les vaques embarassades, vedells i toros reproductors. No obstant això, l'aparició de la immunitat és relativament lenta i la durada de la protecció és més curta, de manera que normalment es requereixen immunitzacions de reforç. En alguns casos, l'eficàcia protectora pot ser més feble que la de les vacunes vives atenuades.
Independentment de si s'utilitza una vacuna viva atenuada o una vacuna inactivada, el procés de purificació aigües avall es pot dividir en quatre etapes principals: collita i clarificació → concentració i purificació primària → purificació de poliment → inactivació/filtració i formulació estèrils.
La concentració és un pas bàsic en el procés de purificació de les vacunes, immediatament després de l'aclariment. El seu objectiu principal és reduir ràpidament la solució clarificada de virus de gran-volum i de baixa-concentració a una forma de-volum petit i alta-concentració mentre es manté la bioactivitat viral. Això crea les condicions necessàries per als passos posteriors de purificació fina d'alta-resolució però de baixa-capacitat, com ara la cromatografia.
Aquest pas normalment es realitza mitjançant ultrafiltració de flux tangencial (TFF). El principi és el següent: la solució d'alimentació viral flueix paral·lela a la superfície d'una membrana d'ultrafiltració amb una mida de porus específica. Sota pressió, molècules petites com aigua, sals i determinades impureses passen perpendicularment a través de la membrana i s'eliminen, mentre que les partícules de virus intactes, que són molt més grans que els porus de la membrana, es retenen, recirculen contínuament i es concentren. En comparació amb la centrifugació tradicional d'-alta velocitat, aquest mètode és més suau per a virus fràgils com l'IBRV, que tenen una embolcall lipídica. Redueix eficaçment el dany estructural del virus i la pèrdua d'activitat causada per forces de cisalla elevades i és més susceptible d'augmentar l'escala lineal-per a la producció industrial.
Una operació de concentració reeixida és molt més que simplement reduir el volum. Els punts clau per a l'optimització del procés inclouen: controlar amb precisió la pressió transmembrana i el cabal d'alimentació per equilibrar l'eficiència de filtració alhora que es minimitza la polarització de la concentració i l'encrassement de la membrana; seleccionar el material de membrana adequat i la mida dels porus per garantir una alta retenció de virus i flux de permeat; i trobar l'equilibri òptim entre la recuperació del virus, el factor de concentració i el temps de processament. La suspensió viral concentrada no només aconsegueix un títol significativament més alt, sinó que també aconsegueix una purificació preliminar eliminant una gran part d'impureses-solubles en aigua. Això proporciona la base de volum i concentració necessària per als passos crítics de refinament posteriors, com ara la cromatografia i el tractament amb nucleases, fent de la concentració un centre d'eficiència central en tot el procés aigües avall.
La diafiltració secundària és un pas crític en la purificació aigües avall de la vacuna, posicionada després de la purificació fina i abans de la formulació. Normalment es realitza després d'un tractament amb cromatografia i nucleases. El seu propòsit principal no és la concentració inicial, sinó l'intercanvi del sistema i l'ajust precís de les condicions finals de la formulació. El procés es realitza en un sistema d'ultrafiltració de flux tangencial (TFF), on s'afegeix contínuament un tampó de formulació net i fresc a la solució viral concentrada circulant, mentre s'eliminen el dissolvent original i les impureses de molècules petites-. Aquesta operació elimina de manera eficaç i suau les sals residuals, els dissolvents orgànics, els productes de degradació de la nucleasa i les impureses solubles que queden del procés de purificació.
La clau és mantenir un volum constant o aplicar ajustos de concentració menors per assegurar-se que la concentració del virus compleix les especificacions de la formulació. Per a virus fràgils i embolcallats com el virus de la rinotraqueïtis infecciosa bovina (IBRV), l'ambient hidrodinàmic suau de la diafiltració secundària és crucial per preservar la integritat i la immunogenicitat de les partícules. En última instància, aquest pas proporciona una base sòlida per a la posterior inactivació (si cal), l'addició d'adjuvant o estabilitzador i l'ompliment final, assegurant que el producte final entri a la formulació amb components definits, condicions uniformes i bona compatibilitat. Per tant, és un dels passos bàsics per garantir la seguretat, l'estabilitat i la coherència de lot-a-de la vacuna.
L'IBRV és un virus d'ADN lineal de doble-cadena amb embolcall amb una embolcall aproximadament esfèrica. Les partícules madures d'IBRV tenen un diàmetre d'uns 160-230 nm. En conseqüència, l'ús de membranes d'ultrafiltració de 100, 300 o 500 kDa pot retenir IBRV mentre s'eliminen algunes proteïnes contaminants. La taxa de recuperació d'ultrafiltració dels cassets de membrana de Jiuling Technology varia segons el tipus de material d'alimentació, però generalment arriba al 90-95%.