Anàlisi completa del procés de fabricació de fàrmacs MRNA: com la tecnologia TFF resol els reptes de purificació
En els darrers anys, la tecnologia de l'ARNm ha aconseguit un gran progrés en el camp biofarmacèutic, demostrant un enorme potencial d'aplicació, especialment en vacunes i teràpia gènica. El desenvolupament exitós de vacunes d'ARNm no només ha proporcionat noves solucions per a la prevenció i el control de malalties infeccioses, sinó que també ha impulsat avenços en la immunoteràpia contra el càncer i la medicina personalitzada. Com a nova classe de productes terapèutics, la fabricació d'ARNm a gran-escala és un gran repte, ja que implica el control de l'estabilitat de l'ARN, l'eliminació d'enzims residuals i els productes de reacció-, l'intercanvi de tampó i l'assoliment d'alts-taxes de recuperació de puresa, tot això requereix tecnologies de fabricació amb solucions{{5}reguladores.
El procés de fabricació de vacunes o terapèutics d'ARNm es divideix principalment en tres etapes: preparació de la solució a granel d'ADN plasmidi, preparació de la solució a granel d'ARNm i preparació del producte farmacèutic ARNm-LNP.
Diagrama de flux del procés de fabricació de fàrmacs d'ARNm
La filtració de flux tangencial (TFF), com a tecnologia de separació de membrana ben{0}}consolidada, s'aplica àmpliament a la fabricació d'ARNm a causa de la seva capacitat de tamisatge molecular d'alta-eficiència, l'intercanvi de tampó controlable i les característiques de baixa tensió de cisalla. D'acord amb el disseny dels mòduls de membrana, les configuracions habituals de TFF inclouen cassets-plans i mòduls-de fibra buida. A més, la separació de membrana impulsada per pressió-en TFF es pot classificar en microfiltració (MF), ultrafiltració (UF), nanofiltració (NF) i osmosi inversa (RO) segons la mida dels porus de la membrana, amb un augment progressiu de la selectivitat.
El TFF té un paper crític en múltiples etapes de la fabricació de fàrmacs d'ARNm, inclosa la preparació de la massa d'ADN plasmidi, la producció a granel d'ARNm i la formulació final de productes farmacèutics d'ARNm-LNP. Mitjançant la selecció adequada del tipus de membrana, el tall-de pes molecular (MWCO) i el material de membrana, el TFF permet l'eliminació eficient dels productes-de reacció i les impureses-moleculars-de baix pes, alhora que facilita l'intercanvi i la concentració de tampó abans i després de l'encapsulació de LNP. Això millora significativament la puresa, l'estabilitat i l'escalabilitat global del procés de l'ARN.
A més, el rendiment de la filtració de flux tangencial està influenciat per factors de configuració del sistema, com ara el tipus de bomba i el disseny de tubs, així com els paràmetres clau del procés, com ara la pressió transmembrana (TMP), l'esforç de cisalla i el flux de filtració. Aquests factors s'han de seleccionar i optimitzar acuradament en funció de les característiques del producte objectiu, especialment per als productes sensibles a l'estrès-com ara l'ARNm-LNP, que són molt susceptibles a les forces mecàniques externes durant el processament.
Purificació del DNA plasmidi
La preparació de la solució de reserva d'ADN plasmidi es basa fonamentalment en el disseny de la seqüència de la plantilla de transcripció. Els mètodes de preparació solen incloure l'amplificació d'ADN plasmidi, encara que també es pot utilitzar l'amplificació per PCR. Prenent com a exemple l'amplificació de l'ADN, dissenyatE. colis'utilitza habitualment per a l'amplificació-basada en fermentació. El procés de purificació aigües avall inclou principalment la recollida de cèl·lules, la lisi i la clarificació, la concentració i l'intercanvi de tampó, la filtració estèril, la linealització i la purificació cromatogràfica. En entorns industrials, la centrifugació de flux continu-s'utilitza sovint per a la recollida de cèl·lules, però genera forces de cisalla relativament altes. Els sistemes de fibra buida, amb els seus canals oberts i baix cisallament, són més adequats per a la manipulació de mostres amb alt contingut de sòlids, alta viscositat o sensibilitat al cisallament, com ara l'ADN plasmidi. Després de la recollida, les cèl·lules es sotmeten a una homogeneïtzació a alta-pressió, ultrasons o lisi alcalina, seguida d'una clarificació preliminar mitjançant filtració en profunditat.
Per facilitar la cromatografia posterior, sovint s'utilitza primer la filtració de flux tangencial (TFF) mitjançant cassettes de membrana o columnes de fibra buida amb retalls de pes molecular-de 30 kDa, 100 kDa o 300 kDa per a la concentració i l'intercanvi de tampó. Això redueix el volum de la mostra alhora que elimina algunes impureses com ara l'ARN, les proteïnes de la cèl·lula hoste (HCP) i els fragments d'ADN de la cèl·lula hoste (HCD). La cromatografia serveix com a pas bàsic de purificació. Normalment, la cromatografia d'intercanvi aniònic (AEX) es combina amb la cromatografia d'interacció hidrofòbica (HIC) per eliminar de manera eficient les impureses i enriquir l'ADN plasmidi superenrotllat altament bioactiu, millorant així significativament la puresa del plasmidi.
Després de la purificació, el plasmidi es torna a sotmetre a TFF per concentrar la solució a la concentració objectiu (normalment 0,5-2 mg/mL) i per realitzar la diàlisi amb el tampó d'emmagatzematge final. Aquest pas elimina les sals residuals i els dissolvents orgànics del procés, assegurant que el sistema tampó compleix els requisits per a les reaccions de transcripció in vitro (IVT) aigües avall.
Purificació de l'ARNm transcrit in vitro (IVT).
La transcripció in vitro (IVT) i la modificació són els processos clau per a la preparació de solucions d'emmagatzematge d'ARNm. Durant la producció d'ARNm d'IVT, s'utilitza una combinació de filtració de flux tangencial (TFF1) - cromatografia - filtració de flux tangencial (TFF2). Aquesta estratègia garanteix una purificació eficient i{4}}d'alta qualitat de l'ARNm, proporcionant un suport fonamental per a la fabricació de vacunes.
Un cop finalitzades les reaccions de transcripció i modificació, normalment es realitza primer l'ultrafiltració/diafiltració mitjançant cassets de membrana o columnes de fibra buida amb retalls de pes molecular{0}}de 30 kDa, 100 kDa o 300 kDa. Aquest pas elimina de manera efectiva diverses impureses-relacionades amb el procés del sistema de reacció, com ara l'ARN polimerasa, els fragments d'ADN residuals, els NTP no reaccionats, els enzims de captació, l'ARN de doble cadena (ARNds) i els inhibidors de molècules petites{-, alhora que s'aconsegueix l'intercanvi d'amortidors. Després d'un sol pas de filtració de flux tangencial, la majoria de les impureses s'eliminen de manera efectiva i l'única impuresa de proteïna residual detectable és l'ARN polimerasa.
Posteriorment, s'apliquen múltiples tècniques de cromatografia per a una purificació posterior. Els mètodes que s'utilitzen habitualment inclouen la cromatografia d'afinitat, la cromatografia d'exclusió de mida-, la cromatografia de fase inversa-de parells d'ions i la cromatografia d'intercanvi d'ions-. Mitjançant aquesta combinació d'ultrafiltració i cromatografia seqüencial, l'ARNm aconsegueix un alt nivell de puresa.
Per satisfer els requisits de formulació o emmagatzematge, la solució d'emmagatzematge d'ARNm es torna a concentrar o diluir mitjançant cassets de membrana de 30 kDa, 100 kDa o 300 kDa o columnes de fibra buida per ajustar amb precisió la concentració objectiu i intercanviar-lo al tampó de formulació final. Finalment, s'aplica una filtració de grau estèril-per controlar la càrrega microbiana, completant l'emmagatzematge temporal i l'ompliment del material.
Exploration of TFF-related process parameters: Relevant studies have shown that a membrane with a molecular weight cut-off (MWCO) of 100 kDa provides the optimal purification efficiency; the transmembrane pressure (TMP) should not exceed 5 psi; and an mRNA concentration of 1 mg/mL ensures a relatively high permeate flux (>25 LMH).
Purificació de formulacions d'ARNm-LNP
Les nanopartícules lipídiques (LNP) són actualment el sistema de lliurament més àmpliament estudiat per a la terapèutica d'ARNm. Actualment, diverses formulacions d'ARNm-LNP es troben en diferents etapes de desenvolupament preclínic i clínic. Els LNP són molt sensibles als processos de fabricació. Entre les operacions unitàries necessàries per a la producció d'ARNm-LNP, la concentració i l'intercanvi de tampó mitjançant la filtració de flux tangencial (TFF) així com la filtració estèril presenten reptes importants. Aquests passos s'han d'optimitzar acuradament per garantir l'escalabilitat del procés i la qualitat del producte, evitant alhora problemes com ara l'encrassement de la membrana i la càrrega incorrecta del filtre.
Després de l'encapsulació de l'ARNm, s'utilitza la filtració de flux tangencial (TFF) per a la purificació. El propòsit d'aquest pas és eliminar l'ARNm no encapsulat, els polímers lliures o els materials lipídics, així com els dissolvents residuals de l'ARNm i els lípids. Com que els LNP d'ARNm-exhibeixen una estabilitat limitada a temperatura ambient, l'optimització dels processos posteriors, inclòs el TFF, és fonamental per mantenir la qualitat del producte.
Les direccions clau d'optimització inclouen: establir adequadament la pressió transmembrana (TMP) i el cabal tangencial en funció de la mida i l'estabilitat de les partícules d'ARNm-LNP per equilibrar l'eficiència de filtració i l'estrès de partícules; seleccionar membranes o columnes de fibra buida amb talls de pes molecular adequats ({1}MWCO, per exemple, 100 kDa o 300 kDa) per eliminar de manera eficient l'ARNm lliure, les impureses i el tampó d'intercanvi alhora que es minimitzen l'adsorció o el dany de partícules; i optimitzar els volums de concentració i diafiltració per garantir un intercanvi efectiu de tampó a la formulació objectiu i controlar la concentració i la dispersitat de partícules finals.
A més, els atributs de qualitat crítics (com ara la mida de les partícules, l'índex de polidispersitat [PDI] i l'eficiència d'encapsulació de l'ARNm) s'han de controlar de prop durant el procés i els paràmetres s'han d'ajustar dinàmicament en funció de dades en -temps real per aconseguir una purificació i formulació estables, escalables i eficients d'ARNm-LNP.
A més, a causa de la inestabilitat de l'ARNm-LNP i dels seus components sota mètodes d'esterilització terminal, normalment s'utilitza un filtre de grau estèril de 0,2 µm per eliminar bacteris i altres contaminants microbians.
