Estudi sobre la capacitat d'eliminació de virus del procés avall d'anticossos monoclonals
Els productes biotecnològics derivats de línies cel·lulars poden estar en risc de contaminació per virus; l'abast depèn d'una sèrie de factors, com ara la font de preparació, les matèries primeres utilitzades, el sistema de producció, els reactius de purificació i els excipients. Estudiar l'eliminació o la inactivació de virus en el procés de fabricació és un pas clau per reduir el potencial de transmissió iatrogènica de virus patògens i reduir així el risc, que és essencial per a la seguretat dels productes. Abans que els productes biològics puguin entrar en assaigs clínics i comercialitzar-se, s'ha de demostrar que el seu procés de producció té la capacitat d'eliminar virus coneguts i presumptes.
01 Avaluació de la seguretat del virus del producte d'anticossos monoclonals
La investigació sobre la capacitat d'eliminació del virus sol ser afegint el virus indicador de títol conegut al producte intermedi en diferents etapes de producció, després determinant el títol de virus residual a la mostra tractada per un procés específic i, finalment, avaluant el valor de reducció logarítmica (LRV) del títol del virus. Els passos del procés per a LRV superiors o iguals a 4log10 es consideren generalment passos efectius per eliminar virus. El procés amb LRV<41og10 can be considered as helpful to increase the total virus clearance in the production process. However, due to the limitations of virus verification, the process with LRV≤11og10 has little significance for virus removal, and its LRV value is not included in the total amount of the production process.
Quan s'utilitza el mètode de procés de producció simulat (procés reduït), és necessari dissenyar un pla d'investigació i prova d'eliminació/inactivació de virus raonable relacionat amb el procés de producció real en la mesura del possible, especialment els passos efectius del procés de producció. El procés simulat ha de ser estrictament coherent amb el procés real en termes de paràmetres de prova i condicions de control.
02 Indica habitualment virus i esquemes de verificació
Els virus indicadors comuns es mostren a la taula 1.
En l'etapa d'aplicació d'investigació de nous fàrmacs (IND), un producte biotecnològic requereix estudis d'eliminació viral per a almenys 2 virus models, normalment seleccionant un retrovirus (X-MuLV) i un parvovirus (MMV). Durant la fase de sol·licitud de llicència de productes biològics (BLA), els estudis d'eliminació de virus normalment es realitzen mitjançant 3-5 virus específics/no específics i s'avaluen 3-5 passos del procés per demostrar que el producte té un factor de seguretat adequat a partir d'un perspectiva de seguretat de virus. A causa de les diferents directrius a casa i a l'estranger, hi ha algunes diferències en els passos de verificació de l'eliminació de virus utilitzats per a les declaracions. Els esquemes de verificació d'eliminació de virus d'ús habitual en el procés de producció de mAb es mostren a la taula 2.
03 Capacitat d'eliminació de virus dels processos posteriors
3.1 La capacitat dels processos posteriors per eliminar diferents virus
A partir de 2009, productes d'anticossos monoclonals enviats a la FDA per a IND i BLA, cromatografia d'afinitat de proteïna A, pH baix, cromatografia d'intercanvi d'anions AEX (mode de penetració de flux), cromatografia d'intercanvi catiònic CEX (mode d'unió - elució) i validació d'eliminació de virus excloent La filtració de virus són les famílies de virus indicadors més utilitzades i la mitjana i el rang dels seus efectes d'eliminació es mostren a la figura 1.
Per als retrovirus, a excepció del CEX, que té un LRV d'uns 3log10 (tal com es mostra al gràfic de barres A de la figura 1), els altres processos eren robusts (LRV superior o igual a 4log10). Els herpesvirus i els retrovirus tenen efectes d'eliminació similars i LRV > 4log10 (tal com es mostra al gràfic de barres B de la figura 1). Els virus petits sense embolcall, com el parvovirus, són més difícils d'eliminar amb eficàcia, són resistents al tractament químic i no són fàcilment atrapats pels filtres (que es mostra al gràfic de barres C a la figura 1). Només els filtres AEX i de virus petits van ser efectius per eliminar parvoviridae (LVR mitjà > 4log10).
Els processos que es mostren a la figura 1 són ProteinA, AEX (mode de penetració de flux), CEX (mode d'elució concomitant), inactivació de pH baix ("eliminació incompleta "versus" completa) i filtració de virus d'obertura gran i petita.
3.2 Factors d'influència dels processos posteriors en la capacitat d'eliminació de virus
La distribució dels valors de LRV per a cada procés es mostra a la figura 2. Els estudis amb 0 ~ 21og10 es van classificar com a grup LRV baix, i els que tenien més de 6log10 es van classificar com a grup LRV alt per a l'anàlisi comparativa.
3.2.1 Cromatografia d'afinitat ProteïnaA
No hi va haver una correlació significativa entre el valor LRV del procés de proteïna A i el tampó d'equilibri/rentat, el farciment, la composició de l'eluent i el valor del pH d'elució. El denominador comú del grup LRV baix és que la matèria primera és força complexa, i pot ser que la complexa interacció de la matèria primera i el farciment afecti negativament la capacitat de la columna cromatogràfica per eliminar virus.
3.2.2 AEX (Flux A través Mode)
Strauss et al. va demostrar que el pH i la conductivitat de les mostres AEX poden afectar el LRV. Tanmateix, els resultats estadístics de Miesegaes et al van demostrar que, de manera similar a ProteinA, el LRV d'AEX (mode de penetració de flux) no tenia una correlació significativa amb diferents tampons, farcits, pH i conductivitat, que pot ser degut a l'optimització del pH i la conductivitat. en les condicions del procés del cas notificat.
3.2.3 CEX (Enllaç - Mode d'elució)
L'eliminació de virus mitjançant el procés CEX no és prou robusta. No hi va haver cap correlació significativa entre el LRV en el grup de LRV alt i el tampó, el nivell d'experiència o cap propietat de columna cromatogràfica, com ara l'alçada de la columna i el tipus de resina. Tanmateix, els valors de pH d'equilibri/càrrega i d'elució utilitzats en l'estudi de LRV alt eren més baixos, a 5,3 ± 0,2; En el grup de LRV baix, el pH era de 6.0±0.2. Un altre factor és que la concentració de sal al tampó també pot provocar la diferència de valor LRV. El tampó utilitzat en l'estudi de LRV baixa tenia una concentració de sal més alta, amb una concentració mitjana de 290 ± 120 mM a la solució de càrrega/equilibri i 340 ± 70 mM a l'eluent, mentre que les concentracions de NaCl a l'estudi de LRV alt van ser de 58 ±27 mM i 183±31 mM respectivament.
3.2.4 Inactivació de pH baix
En el procés de pH baix, el pH és un paràmetre clau del procés i un pH de 3,8 és suficient per inactivar el retrovirus per graus. El grup de LRV baix tenia un pH de 3,9, mentre que l'estudi de LRV alt tenia un pH de 3,4.
3.2.5 Eliminació del filtratge de virus
Tant per als filtres d'obertura petita com per a gran, el valor LRV de l'eliminació de MuLV no va ser inferior a 2log10 i només l'1% dels estudis estaven per sota de 3log10 (que es mostra a les columnes h i i a la figura 2). L'eliminació global de retrovirus mitjançant filtres de virus d'obertura gran va ser inferior a la dels filtres de virus d'obertura petita (tal com es mostra al gràfic de barres C de la figura 1). El motiu principal que afecta el resultat de l'eliminació del parvovirus són els diferents tipus de filtre. En general, el filtratge antivirus pot eliminar virus de manera fiable.
Els processos són Proteïna A (a), mode de penetració AEX (b), unió CEX - mode d'elució (c), unió AEX Ⅰ mode d'elució (d), inactivació de pH baix ("complet "i "complet") (e ~ g), i la mida de porus gran (h) i la mida de porus petita (i ~ j) filtració de devirus (on, a ~ i: Retrovirus; j: Parvovirus).
04 Innovacions i reptes en l'avaluació de la seguretat de virus
El desenvolupament i la innovació continus en el camp dels processos biofarmacèutics aigües avall provocaran inevitablement innovacions en l'avaluació de l'eliminació de virus. Els avenços en els processos aigües amunt i aigües avall, com ara els bioprocessos de flux continu, han fet necessari avaluar i establir processos d'eliminació de virus efectius i sòlids. Durant el flux continu, encara s'espera que passos com la inactivació de virus i el filtratge de virus es realitzin en mode per lots. Tot i que la capacitat d'eliminació de virus dels processos cromatogràfics en mode de flux continu no hauria de ser substancialment diferent de la del processament per lots, s'ha de recolzar amb dades.
05 Perspectiva
Des d'una perspectiva de seguretat virològica, l'excel·lent seguretat de la indústria biofarmacèutica es pot atribuir en gran mesura a l'adhesió estricta de la indústria a tres estratègies clau per a la seguretat viral: proveïment i prova adequats de fonts de materials i bancs de cèl·lules, documentar avaluacions d'eliminació viral (estudis de validació de virus) i proves virals en procés. Les característiques dels fàrmacs biològics produïts per nous substrats cel·lulars poden canviar amb diferents riscos, i es requereixen bones estratègies de gestió del risc per garantir la seguretat dels fàrmacs biològics. Guidling Technology ha experimentat un equip tècnic professional, que cobreix el procés de filtració des de la petita prova, la prova pilot fins a la producció a gran escala, els nostres filtres de membrana i membrana s'utilitzen àmpliament en prefiltració, microfiltració, ultrafiltració, concentració de nanofiltració, extracció i separació; Les nostres nombroses línies de productes, des de petites filtracions de laboratori d'un sol ús fins a sistemes de filtració orientats a la producció, proves d'esterilitat, fermentació, cultiu cel·lular i molt més, garanteixen una major productivitat.
Jiuling per garantir la qualitat del producte com a primer indicador, a la recerca de "reduir costos, augmentar l'eficiència" en el camí a explorar, esperant treballar amb vosaltres en el futur per afrontar els reptes de la indústria i buscar un millor desenvolupament.