Estudi sobre el procés de clarificació del lisat de fermentació d'alta densitat d'Escherichia Coli recombinant
Per tal de reduir la interferència del fluid material a la cromatografia i millorar la recuperació de la proteïna diana, es va estudiar el procés de clarificació del lisat de fermentació d'alta densitat de dues soques d'Escherichia coli recombinant. Es van seleccionar les soques BL21-HP1036 i BL21-palA que expressen gens clau de Streptococcus suis i Haemophilus parasuis. El procés de flux tangencial, el procés de centrifugació d'alta velocitat i el procés de clarificació del casset de membrana es van utilitzar per avaluar el rendiment de proteïnes mitjançant la detecció de terbolesa i electroforesi.
Els resultats van mostrar que BL21-HP1036, BL21-palA lisat de fermentació d'alta densitat que expressava gens clau de Streptococcus suis i Haemophilus parasuis es va aclarir mitjançant filtració i centrifugació de casset de membrana, i el rendiment de proteïnes va ser superior al 80%, que podria reduir eficaçment la interferència cromatogràfica i millorar la taxa de recuperació.
Introducció
En l'actualitat, Streptococcus suis (SS) i Haemophilus parasuis (HPS) són els patògens de malalties bacterianes més freqüents a les granges porcines, que comporten grans pèrdues a la indústria porcina. La SS es pot dividir en un total de 35 serotips 1-34 i 1/2, i l'HPS es pot dividir en 1-15 serotips, i els dos sovint es barregen, causant principalment poliserositis porcina, artritis, meningitis, endocarditis. , septicèmia bacteriana i bronquitis.
A causa del gran nombre de serotips de Streptococcus suis i Haemophilus parasuis, la protecció creuada entre diferents serotips és feble i la resistència als antibiòtics augmentarà significativament quan es tracta amb antibiòtics, la qual cosa afectarà l'efecte terapèutic.
Les vacunes s'han convertit en un dels mitjans eficaços per prevenir la SS i la HPS. Hi ha vacunes inactivades, vacunes atenuades, vacunes vives, vacunes subunitats i vacunes modificades genèticament, però les vacunes inactivades i les vacunes atenuades es troben principalment al mercat, i la seva protecció immune és bona, però la protecció creuada no és òbvia. La vacuna subunitat és un nou tipus de vacuna contra l'estreptococ suis, que és un nou tipus de vacuna amb una forta protecció creuada i un preu baix. La investigació i desenvolupament de vacunes de subunitats de Streptococcus suis i Haemophilus parasuis ofereix una solució perfecta als problemes de prevenció i control de Streptococcus suis i Haemophilus parasuis que pateixen la indústria porcina a la Xina.
Les vacunes de la subunitat Streptococcus suis i Haemophilus parasuis estan sotmeses a una fermentació d'alta densitat per Escherichia coli recombinant. La clarificació del lisat té un gran efecte en el rendiment de proteïnes diana, però hi ha pocs informes rellevants. Com realitzar l'etapa de clarificació del procés de fermentació i purificació és un treball important. En aquest article, la fermentació d'alta densitat d'E. coli recombinant BL21-HP1036, BL21-palA com a objecte, per estudiar com reduir eficaçment la terbolesa de la solució de clarificació, millorar el rendiment de proteïnes, per Procés de fermentació de la vacuna de la subunitat Streptococcus suis per aconseguir la tecnologia de trituració i clarificació industrial per proporcionar una base teòrica i suport tècnic.
1. Materials i mètodes
1.1 Materials
1.1.1 Soques
Soques de Streptococcus suis i Haemophilus parasuis BL21-HP1036, BL21-pa-lA
1.1.2 Principals medis i reactius
extracte de llevat i marsopa; clorur de sodi; Kanamicina, IPTG; Formaldehid de; Kit de gel SDS-PAGE.
1.1.3 Equip de prova principal
Fermentador d'alta densitat; Centrífuga d'alta velocitat; Aparells d'electroforesi; sistema d'imatge en gel ultraviolat; trituradora d'ultrasons; Petita centrífuga d'alta velocitat; espectrofotòmetre ultraviolat; Taula agitadora de temperatura constant; Equip de cromatografia d'afinitat.
1.2 Mètodes
1.2.1 Cultiu de fermentació d'alta densitat
Les soques de coliformes recombinants qualificades BL21-HP1036 i BL21-pa-lA es van inocular en medi sintètic al 2% (V/V) i es van cultivar a 37 graus durant 35-40 h.
1.2.2 Expressió induïda per proteïnes recombinants
Quan la solució de fermentació OD{{0}}±0.1, va començar la inducció, la temperatura d'inducció era de 35 graus ± 0,5 graus i el cultiu es va acabar després de 10 h d'inducció.
1.2.3 Trituració i centrifugació homogènia a alta pressió
El líquid de bacteris que va passar la prova d'inactivació va ser triturat per un homogeneïtzador d'alta pressió per a l'esquerda cel·lular, respectivament, amb una pressió de 100 ~ 150 MPa. Després de la trituració, el líquid triturat es va mantenir a baixa temperatura.
El sobrenedant es va obtenir per centrifugació a alta velocitat, velocitat centrífuga: 15000 rpm, control de temperatura: 10 graus ~ 15 graus, velocitat d'injecció: 0,5 ~ 1 L/min, respectivament, es va recollir el sobrenedant i el el sobrenedant es va omplir amb recipients que eliminaven l'endotoxina.
1.2.4 Aclariment de casset de membrana de microfiltració
La membrana es va rentar amb 10L d'aigua purificada en una direcció i es va dur a terme una filtració de flux tangencial. Es van extreure 300 ml de la suspensió bacteriana trencada després de la centrifugació de la centrífuga de la canonada i es van aclarir amb un casset de membrana de microfiltració de 0,45 um. La terbolesa es va mesurar mitjançant mostreig respectivament i es va comparar la terbolesa després de la centrifugació, la terbolesa del líquid clarificat al casset de membrana de microfiltració i la terbolesa del líquid concentrat al casset de membrana de microfiltració. El contingut de proteïnes de la mostra es va detectar mitjançant cromatografia i electroforesi per avaluar el rendiment de proteïnes.
Pas 2: Resultats
2.1 Dades d'aclariment i resultats de les proves de la proteïna BL21-HP1036 i BL{21-palA
Els resultats de la FIG. 1 mostren que la terbolesa del fluid de trituració d'Escherichia coli recombinant BL21-HP1036 i BL21-palA va disminuir de 4 500 NTU i 4 000 NTU a 1970 NTU i 520 NTU, respectivament, després de la centrifugació del tub. La terbolesa de BL21-HP1036 i BL21-palA Escherichia coli recombinant es va reduir a 25 NTU i 1,28 NTU mitjançant el mètode de casset de membrana de microfiltració. Es pot veure que l'ús de la filtració de flux tangencial de casset de membrana de microfiltració i un canal de flux obert optimitzat té un bon efecte en la reducció de l'endotoxina, la viscositat i la terbolesa del líquid cromatogràfic que la filtració tradicional per centrífuga, i pot reduir significativament l'heteroproteïna d'E. coli recombinant trencada. i àcid nucleic.
2.2 Recuperació de proteïnes de mostres de BL21-HP1036 i BL21-palA
La taula 1 mostra que la proteïna Escherichia coli BL21-HP1036 recombinant existeix tant a la solució clarificada de microfiltració com al sobrenedant concentrat cobert per la membrana de microfiltració, i el rendiment total de proteïna després de recuperar la proteïna de la solució clarificada de microfiltració i el sobrenedant concentrat. és d'un 88,5%. La proteïna BL21-palA també existia a la solució clarificada d'exsudat de microfiltració i al sobrenedant de la solució concentrada coberta per un casset de membrana de microfiltració. El rendiment total de la proteïna BL21-PALa va ser del 81,5%.
3. Conclusió
En aquest article, les soques que expressen els gens clau BL{{0}}HP1036 i BL21-palA de Streptococcus suis i Haemophilus parasuis, respectivament, van patir una fermentació d'alta densitat i van passar 0,45 La terbolesa del líquid material va ser reduït significativament pel procés de casset de membrana de microfiltració um, cosa que indica que la tecnologia de filtració de flux tangencial amb casset de membrana de microfiltració era millor que la de la centrífuga d'alta velocitat i podria reduir significativament la proteïna d'impuresa i l'àcid nucleic de l'Escherichia coli recombinant trencat.
Després de recollir el líquid clar al casset de membrana de microfiltració únic, hi havia un 62,9%, ja que el 37,1% de la proteïna objectiu de BL21-HP1036 era concentrat de microfiltració o existia al casset de membrana de microfiltració i altres pèrdues. , es va adoptar un mètode de dos passos per a l'aclariment. En el primer pas, es va utilitzar un casset de membrana de microfiltració de 0,45 um per aclarir i recollir l'exsudat; en el segon pas, el líquid concentrat restant es va recollir després de la centrifugació del tub, i el líquid clarificat de dos passos es va combinar com a mostra cromatogràfica. El valor de terbolesa del líquid de fermentació BL21-palA no va augmentar significativament, el rendiment de proteïnes va poder assolir més del 85,5% i el rendiment proteic del líquid de fermentació BL21-Pala podria arribar al 81,5% després d'un tractament en dos passos.
Pel que fa a com triar el casset de membrana de microfiltració, Guidling Technology us pot oferir solucions d'alta qualitat. Els nostres productes de la sèrie de cassets de membrana de microfiltració i cassettes de membrana d'ultrafiltració utilitzen polièter sulfona com a portador, especialment dissenyat per a la biotecnologia. La nostra membrana de polièter sulfona té els avantatges d'un alt rendiment, baixa adsorció de proteïnes, alta resistència mecànica, resistència a l'impacte, etc. Us proporcionem pinces especials de membrana per mesurar la pressió d'entrada i sortida en temps real, i podem oferir visites tècniques segons les vostres necessitats per personalitzar el vostre sistema especial d'ultrafiltració/microfiltració. Aquest petit sistema de flux tangencial es pot utilitzar per a la producció a petita, pilot i a petita escala, i pot ser una amplificació totalment lineal per satisfer completament els vostres requisits de prova i de producció.
Sobre Guidling
Guidling Technology és una empresa nacional d'alta tecnologia centrada en productes biofarmacèutics, cultiu cel·lular, purificació i concentració de biomedicina, diagnòstic i fluids industrials. Hem desenvolupat amb èxit dispositius de filtre centrífug, cassets d'ultrafiltració i microfiltració, filtre de virus, sistema TFF, filtre de profunditat, fibra buida, etc. Que compleixen plenament els escenaris d'aplicació de biofarmacèutics, cultiu cel·lular, etc. Les nostres membranes i filtres de membrana s'utilitzen àmpliament en concentració, extracció i separació de prefiltració, microfiltració, ultrafiltració i nanofiltració. Les nostres nombroses línies de productes, des de la petita filtració de laboratori d'un sol ús fins a sistemes de filtració de producció, proves d'esterilitat, fermentació, cultiu cel·lular i més, satisfan les necessitats de proves i producció. Guidling Technology està desitjant cooperar amb vosaltres!