Tecnologia de membranes i clarificació de vacunes (Ⅰ)
Les vacunes provenen de diverses fonts, com ara extractes de teixits, cèl·lules bacterianes, partícules virals, proteïnes i àcids nucleics produïts per cèl·lules recombinants de mamífers, cèl·lules de llevats i insectes.
El mètode més comú de producció de vacunes es basa en un procés de fermentació inicial seguit de purificació. La producció de vacunes és un procés complex que implica molts passos i processos diferents. L'elecció del mètode de purificació adequat és fonamental per aconseguir la puresa del producte final desitjada. La clarificació de les vacunes és un pas important que té un impacte significatiu en la recuperació del producte i la posterior purificació aigües avall. Es poden utilitzar diverses tècniques per aclarir les vacunes. L'elecció del mètode i l'equip de recollida depèn del tipus de bateria, de la naturalesa del producte que es recull i del líquid del procés. Aquestes tècniques inclouen filtració de membrana (microfiltració, filtració de flux tangencial), centrifugació i filtració profunda (filtració de flux normal). A partir d'una llarga experiència, la clarificació de la collita de la vacuna s'aconsegueix normalment per centrifugació seguida d'una filtració profunda.
En els darrers anys, les tècniques basades en membrana han guanyat protagonisme en la clarificació de vacunes. Els processos aigües amunt utilitzen cada cop més tecnologies d'un sol ús, de manera que les estratègies de collita han de canviar. Aquest article ofereix una visió general de diferents tecnologies basades en membranes i les seves aplicacions en la clarificació de vacunes.
01 Introducció
Les vacunes són un component crític de la nostra prevenció de malalties infeccioses, que segueixen sent una causa impactant de mort. Entre 2 i 3 milions de persones es salven de la diftèria, el tètanus, la tos ferina i el xarampió cada any gràcies a la immunització. Les vacunes cobreixen una àmplia gamma, des de petites proteïnes recombinants fins a partícules senceres de virus i bacteris sencers. Poden ser produïdes per diferents sistemes: ous, cèl·lules de mamífers, bacteris, etc. A causa de la complexitat i diversitat de les vacunes, actualment no hi ha cap protocol o plantilla de purificació convencional, malgrat l'interès creixent per les plataformes de vacunes.
Normalment, un procés de vacunació es pot dividir en tres parts: aigües amunt (producció i clarificació), tractament aigües avall (purificació que inclou ultrafiltració, cromatografia i tractament químic) i formulació (operacions d'ompliment final). Independentment del sistema de producció, la clarificació (l'eliminació inicial de substàncies no desitjades) juga un paper clau a l'hora de determinar un procés de purificació robust. Un pas de clarificació adequat elimina principalment cèl·lules senceres, restes cel·lulars, col·loides i grans agregats per reduir la càrrega del processament aigües avall. En alguns casos, la clarificació també pot reduir les impureses insolubles, les proteïnes de la cèl·lula hoste (HCP) i els àcids nucleics de la cèl·lula hoste. Com qualsevol altre pas de purificació, l'etapa de clarificació s'ha d'optimitzar per aconseguir el màxim rendiment i puresa del producte alhora que s'adapta a l'especificitat i les limitacions de producció de la vacuna.
A causa de l'heterogeneïtat dels tipus de vacunes, s'utilitzen diverses tècniques per a la clarificació, inclosa la centrifugació o la filtració (taula 1).
Normalment es requereixen diverses sèries d'operacions per aconseguir l'aclariment desitjat. La primera operació està dissenyada per eliminar partícules més grans (clarificació primària) i la segona operació està dissenyada per eliminar col·loides i altres partícules submicròniques (clarificació secundària). La centrifugació a baixa velocitat serveix com a opció de clarificació única, permetent que les cèl·lules i les restes cel·lulars s'eliminin per precipitació. La centrifugació pot manejar càrregues sòlides elevades i s'ha utilitzat àmpliament en el mode continu o per lots i centrífugues de disc. Requereix una inversió de capital elevada i costos de manteniment, i s'enfronta a reptes a l'hora d'ampliar-se a causa de la manca d'un model de reducció fiable. Tanmateix, alguns fabricants comercials de vacunes utilitzen centrífugues en la producció a gran escala que implica grans volums de processament i més activitats de producció.
La filtració de clarificació es pot realitzar mitjançant filtració de flux normal (NFF, també coneguda com a filtració sense sortida) o filtració de flux tangencial (TFF, també coneguda com a filtració de flux creuat). També hi ha modes de filtre específics (filtres profunds) que contenen materials carregats positivament i filtre SIDA que milloren la retenció de restes cel·lulars, col·loides i components no desitjats carregats negativament.
Els filtres de membrana retenen partícules per exclusió de mida i no tenen una gran capacitat de retenció de brutícia, per la qual cosa són adequats per a passos secundaris de clarificació. Tant els filtres profunds com els filtres de membrana són fàcils d'escalar i implementar (disseny de sistema senzill). A diferència del NFF, el TFF s'utilitza principalment per a la clarificació primària (microfiltració). Les membranes amb un rang de tall de 0.1-0,65 μm (preferiblement amb un canal obert) s'han utilitzat amb èxit per retenir cèl·lules, restes cel·lulars i altres contaminants grans. La majoria dels equips TFF són linealment escalables i reutilitzables després de la neteja, la qual cosa redueix significativament el cost dels consumibles per al pas.
El pas de clarificació es troba entre els processos aigües amunt i aigües avall i de vegades es passa per alt durant el desenvolupament del procés de la vacuna perquè es prioritzen el temps i els recursos per a altres passos de purificació, com ara la cromatografia o la centrifugació del gradient de densitat.
Fins i tot les patents dels processos de fabricació de vacunes sovint ometen el pas d'aclariment. L'eficiència de clarificació afecta directament el rendiment del procés aigües avall. Un pas de clarificació poc optimitzat pot afectar negativament la capacitat del filtre esterilitzat o escurçar la vida útil de la resina cromatogràfica. Avui dia, les expectatives regulatòries més estrictes tendeixen a fer que els fabricants de vacunes produeixin vacunes més pures, ben caracteritzades però assequibles. En aquest cas, cal donar a cada pas l'atenció que es mereix. Les tendències actuals suggereixen que el procés aigües amunt s'està movent cap a un sistema d'expressió "més net" (és a dir, les cèl·lules cultivades en medis sense sèrum substitueixen els ous) amb una productivitat més gran i una densitat cel·lular més alta.
Els processos de purificació aigües avall s'estan simplificant i racionalitzant per augmentar la puresa del producte final. Per gestionar aquests canvis, el pas d'aclariment no es pot convertir en un coll d'ampolla. En aquest cas, la tecnologia de filtració compleix un nou repte de clarificació, abordant els problemes de l'augment de la flexibilitat del procés, la possibilitat d'un sol ús i la reducció dels costos d'inversió.
02 Aclariment de les vacunes virals
Diversos tipus de mètodes de clarificació, ja siguin sols o combinats, s'han utilitzat amb èxit per aclarir la collita al final de l'alimentació de les vacunes.
Escala pilot:1-20L, escala de producció: més de 20L
2.1 Precaucions per a l'aclariment de la vacuna viral
Moltes vacunes contenen totes o part de les partícules del virus per formar immunitat contra la infecció viral. Generalment es divideixen en quatre grans categories:
Vacuna viva atenuada (LAV), que es basa en una soca debilitada del virus per reduir-ne la virulència. Els virus atenuats es poden replicar al cos però no són patògens.
- Vacunes de virus inactivats (IV), que contenen virus inactivats químicament o ultraviolats per eliminar la infectivitat. Les partícules de virus es poden completar, dividir o purificar (només proteïnes antigèniques).
- La vacuna del vector viral (VV) és un virus actiu, no patogènic, que presenta l'antigen d'un virus patògen. Aquestes estructures desenvolupades recentment també s'utilitzen per a aplicacions de teràpia gènica.
Vacunes de partícules similars a virus (VLP), una classe específica de vacunes de subunitats virals que imiten l'estructura general de les partícules virals però no contenen material genètic infecciós.
En la majoria dels casos, les partícules virals estan completament intactes durant l'etapa de clarificació, fins i tot durant la lisi de la vacuna viral (la divisió es realitza normalment aigües avall, en un entorn més purificat).
El principal repte de la clarificació viral és la recuperació de partícules virals d'alt rendiment alhora que s'eliminen de manera eficient les restes cel·lulars, els grans agregats i els contaminants insolubles. Tal com es descriu a les seccions següents, hi ha diversos factors que poden provocar la degradació o la pèrdua del virus. A més, pot ser difícil confiar en el rendiment viral a causa de l'alta variabilitat dels mètodes d'assaig quantitatiu viral en aquesta etapa del procés, especialment per a les vacunes LAV i VV. Per a aquestes vacunes, el rendiment viral s'avalua sovint mitjançant proves d'infectivitat com la prova de placa o la prova TCID 50. El fet que alguns dels compostos recollits puguin interferir amb la capacitat del virus d'infectar cèl·lules indicadores augmenta la variabilitat d'aquest enfocament quantitatiu.
2.2 Estratègia de clarificació de la vacuna contra virus
Les vacunes víriques varien molt en mida, estructura, forma i sistemes d'expressió (taula 3).
Com a resultat, generalment no hi ha cap plantilla per als seus processos posteriors, especialment els passos d'aclariment. En teoria, totes les tècniques disponibles (centrifugació a baixa velocitat, microfiltració TFF, NFF) es poden seleccionar i potencialment combinar per aclarir el virus. De fet, l'èxit dels mètodes de clarificació està influenciat pel sistema d'expressió i les propietats fisicoquímiques dels virus implicats.
Recently, the high cell density process of viral vaccines is being explored. High cell density processes add to the challenge of clarification. Many treatment methods are by preconditioning, i.e. polymer-induced flocculation, precipitation, alternating TFF, etc. For example, Tomic et al. describe a method for high cell density collection (>El mètode de clarificació de {{0}} cèl·lules /ml), utilitzant polímers catiònics, va reduir l'àrea de filtració profunda en 4 vegades en comparació amb els mètodes tradicionals. Aquesta tècnica permet la recol·lecció de fermentadors de gran capacitat sense l'ús de centrífugues. De la mateixa manera, Riske et al. va demostrar que el tractament amb quitosà de cultius cel·lulars de 40 L (0,02%) que contenien 1,{6}},6% de sòlids va provocar un augment 7-de vegades de la capacitat de filtre absoluta després d'una filtració profunda.
També esmenten que el quitosà sembla millorar l'eficiència de la clarificació floculant partícules submicròniques, que normalment s'instal·len a les centrífugues. És probable que els mètodes de pretractament i floculació continuïn formant part dels futurs aclariments de filtració de vacunes. Els penetrants, inclosos els sucres, els glicols i els aminoàcids, floculen preferentment els virus. La floculació viral amb solució osmòtica seguida d'una microfiltració de 0,2µ es pot utilitzar com a procés complet per a la purificació de virus. Els penetrants poden estimular l'agregació viral reduint la capa d'hidratació al voltant de les partícules per flocular partícules de virus hidrofòbiques no encapsulades i partícules de virus encapsulades. Tot i que s'ha demostrat que els penetrants floculen virus, el mètode té el potencial de ser una plataforma per a la futura purificació de vacunes i no s'ha demostrat la seva viabilitat en la purificació de vacunes pilot o a gran escala. El mètode de pretractament de floculació, que probablement continuarà formant part de la futura clarificació del filtre de la vacuna, es realitza en un fermentador de 2 litres. Per poder utilitzar-los potencialment en operacions de producció a gran escala, aquests mètodes s'han de validar a escala pilot i de producció.
2.2.1 Expressió de l'impacte del sistema
El mètode de clarificació depèn principalment del tipus de procés amunt i del sistema d'expressió, que determina el tipus i el nivell de contaminants a eliminar. Les vacunes víriques solen produir-se en embrions de pollastre mitjançant línies cel·lulars contínues de mamífers o aus o cèl·lules de baculovirus/insectes, que són un sistema d'expressió més complex. Alguns tipus de VLP també poden ser produïts per altres sistemes d'expressió heteròlegs (bacteris, llevats, cèl·lules vegetals).
2.2.1.1 Virus produït en embrió de pollastre
Les vacunes es produeixen en ous durant dècades. Aquest treball es remunta al 1931, quan Woodruff i Good Pasture van utilitzar amb èxit la membrana corio-alantoica dels ous fèrtils com a substrat per al creixement viral. Avui dia, moltes vacunes humanes i veterinàries encara es produeixen mitjançant aquest antic procés. La més coneguda és probablement la vacuna contra la grip estacional. El principi és inocular els ous de gallina amb virus d'interès i després replicar-los a la membrana corio-alantoica. Després de la reproducció, es recull i es purifica el líquid alantoide ric en partícules víriques.
El líquid alantoic és un aliment clarificador difícil. El seu alt contingut en minerals i proteïnes (inclosa l'ovalbúmina) li confereix una alta viscositat. El líquid alantoide també conté compostos essencials dels teixits d'embrions de pollastre, com ara plomes, becs, vasos sanguinis o cèl·lules sanguínies. A causa de l'alt contingut de sòlids, la centrifugació a baixa velocitat és l'opció preferida per a la clarificació primària, que normalment dóna com a resultat una taxa de recuperació d'aproximadament el 70%. Tanmateix, també és possible la clarificació primària mitjançant tècniques de filtració. Per a NFF, els filtres profunds a base de polipropilè i cel·lulosa tenen bones capacitats de recollida de fluids alantoics. Els filtres de superfície fabricats amb filtres profunds a base de polipropilè o cel·lulosa poden tenir una capacitat de 150-210 L/m² i reduir la terbolesa del flux d'alimentació fins a 3 vegades. El dispositiu TFF de canal d'alimentació obert també és adequat per a la clarificació del fluid alantoic, ja que el dispositiu és més adequat per a una pèrdua de pressió mínima a través del canal d'alimentació, reduint així l'obstrucció del canal.
El pas d'aclariment secundari es pot fer fàcilment amb NFF. Una combinació de materials de polipropilè, cel·lulosa i fibra de vidre generalment mostra una bona eficiència, i una alternativa al pas de clarificació secundari és utilitzar TFF i un dispositiu de membrana de microfiltració de {{0},65μm o 0,45μm i operar el flux osmòtic. control. En aquest pas es pot utilitzar un dispositiu TFF de canal obert amb un PVDF hidròfil o una membrana PES hidròfila.
És important tenir en compte que les partícules virals poden estar associades amb material de deixalles insolubles, que pot reduir significativament la producció viral durant la clarificació. L'ús d'una solució de sal pot reduir aquesta associació entre els virus de la grip i els fragments sòlids, donant lloc a un augment aproximadament del doble de la producció sense afectar la integritat de les partícules virals.
2.2.1.2 Virus produïts en successives línies cel·lulars de mamífers i aus
Recentment, algunes vacunes virals s'han allunyat dels processos basats en ous a favor dels processos basats en cultius cel·lulars (especialment per a les vacunes contra la grip). La raó principal d'aquest canvi és prevenir els problemes de producció de vacunes associats als ous embrionaris (és a dir, l'escassetat de subministrament d'ous que es pot produir en cas d'un brot de malaltia avícola). Com a resultat, actualment es desenvolupen molts tipus de vacunes i vectors virals utilitzant línies cel·lulars contínues de mamífers o aus, línies cel·lulars convencionals (com ara línies cel·lulars Vero, MDCK o HEK293) o línies cel·lulars pròpies.
Depenent del sistema d'expressió, el virus pot romandre a l'interior de la cèl·lula, requerint un pas de lisi cel·lular, o pot romandre fora de la cèl·lula (lisi o brotació). La càrrega sòlida i el contingut soluble obtingut del cultiu cel·lular són molt més nets que la fase líquida alantoica. Com a resultat, la tecnologia NFF és més fàcil d'implementar i la capacitat és significativament més gran. Tanmateix, la capacitat de filtració depèn molt de les condicions del cultiu cel·lular, com ara la densitat cel·lular o la viabilitat cel·lular a la collita. Aquests paràmetres afecten la quantitat de restes cel·lulars i macroagregats que poden obstruir filtres i membranes profunds, donant lloc a una capacitat reduïda.
Thomassen et al ofereixen un bon exemple d'aclariment de NFF. S'utilitza en el procés de producció de poliovirus inactivat (IPV). Les cèl·lules Vero cultivades en microportadors es van utilitzar per a la proliferació viral amb una densitat cel·lular de {{0}},78 x 106 cèl·lules/ml TOI. S'utilitza una pantalla d'acer inoxidable de 75 μm per a la clarificació prèvia per eliminar els microportadors de la collita. La classificació de doble capa s'aclareix mitjançant un filtre profund de densitat (0.2-2.0μm), seguit d'un filtre de grau esterilitzat.
La unitat d'un sol ús escalable seleccionada es va utilitzar amb èxit per a la preparació de material d'assaig clínic Sabin IPV a escala de 350 L. Depenent del serotip del virus, s'obté una taxa de recuperació del virus del 86 al 96 per cent.
2.2.1.3 Partícules semblants a baculovirus/virus produïdes al sistema de cèl·lules d'insectes
La consideració dels sistemes de cèl·lules de baculovirus/insectes per a la producció de vacunes a gran escala és relativament nova, però està despertant un interès creixent en el camp dels vectors virals i VLP. El principal avantatge d'aquest sistema és que implica una producció de curta durada (no cal establir línies cel·lulars) i segura (sense ADN viral complet). També hi ha alguns desavantatges, com ara la necessitat d'eliminar el baculovirus i l'estabilitat del producte.
Cervarix, una vacuna VLP contra la infecció pel virus del papil·loma humà produïda per GlaxoSmithKline, és la primera vacuna humana que es produeix comercialment en cèl·lules d'insectes. Actualment s'estan desenvolupant diverses vacunes basades en VLP i vectors rAAV produïts en cèl·lules d'insectes infectades per baculovirus. Les línies cel·lulars d'insectes derivades del cuc de la tardor Spodoptera frugiperda (Sf9 i Sf21) i del cuc de la col Trichoplusia ni (cèl·lules BTI-TN5B1-4) són les més utilitzades per la seva capacitat de créixer en suspensió, la qual cosa simplifica l'amplificació del corrent amunt. procés. Després de créixer fins a la densitat desitjada de cèl·lules vives, aquestes cèl·lules s'infecten amb baculovirus recombinant en la fase de creixement cel·lular exponencial per a l'expressió de proteïnes. El gran genoma dels baculovirus permet l'expressió de cinc o més proteïnes diferents, la qual cosa coincideix amb la complexitat de VLP i vectors virals.
Bernard et al. va descriure el procés aigües avall del cultiu de cèl·lules d'insectes. El procés és molt variable, reflectint la diversitat de proteïnes produïdes amb aquesta tècnica. El primer pas de la seqüència de purificació està molt influenciat per les característiques de volum del bioreactor (és a dir, la densitat cel·lular i la viabilitat), o per la naturalesa de l'alliberament del producte (secretat per la gemació o la lisi cel·lular). La infecció per baculovirus de cèl·lules d'insectes pot provocar la lisi cel·lular en 3-5 dies. La destrucció de cèl·lules pot provocar un augment de l'activitat proteolítica i altres factors ambientals que poden provocar la degradació de proteïnes recombinants.
Hi ha hagut intents de desenvolupar baculovirus amb una capacitat menor per iniciar la lisi cel·lular. El baculovirus lisa menys del 10% dels insectes infectats.
La lisi cel·lular es pot realitzar mitjançant diferents mètodes, com ara congelació-descongelació, detergents, homogeneïtzadors o tractament amb ultrasons. Les cèl·lules dels insectes no tenen paret cel·lular i, per tant, es dissolen ràpidament. Tot i que s'ha informat del tractament ultrasònic en molts processos de banc, rarament s'utilitza a escala experimental o comercial. El mètode més comú és utilitzar un homogeneïtzador per destruir cèl·lules en presència d'un detergent de baixa concentració (0,1% Triton X-100 o NP-40). L'ús de detergents i la microfluidització o l'homogeneïtzació d'impacte osmòtic s'han utilitzat amb èxit en molts processos de fabricació a gran escala. Normalment, les cèl·lules d'insectes es suspenen en tampons de lisi (50 mM TRIS pH 7,7, 300 mM NaCl, 5% glicerol, 0,2 mM PMSF i inhibidors de la proteasa), durant el qual Triton-X100 s'afegeix a una concentració final del 0,1%, seguida d'ecografia suau o microfluidització. A continuació, la mescla es centrifuga per eliminar les partícules insolubles.
En aquesta etapa, el lisat pot semblar molt tèrbol i és difícil de filtrar amb un filtre de 0,45 μm. De vegades es poden observar pèrdues de fins a un 30% durant l'etapa de clarificació de la piròlisi. L'addició de benzoenzims en l'etapa d'escissió ajuda a resoldre el problema de filtració. La neteja de les cèl·lules amb salmorra tamponada amb fosfat després de la collita i la "congelació-descongelació" ràpida en una sal alta (500 mM de NaCl) que conté el tampó de craqueig ajuda a eliminar els agregats.
La clarificació de VLP i vectors virals produïts per cèl·lules d'insectes es produeix després de la lisi cel·lular (mitjançant tractament químic o mecànic), que allibera no només partícules virals sinó també grans quantitats d'àcid nucleic cel·lular. Les cèl·lules d'insectes poden créixer a una densitat cel·lular elevada, a partir de 1-9.10 6 cèl·lules/ml. Per tant, l'etapa d'aclariment hauria de tractar una alta densitat cel·lular, un alt contingut d'àcid nucleic i, si és possible, l'eliminació de partícules de baculovirus. Per complicar les coses, els VLP o els vectors virals i els baculovirus poden tenir mides similars (els baculovirus tenen 60-80 nanòmetres d'amplada i 300-400 nanòmetres de llarg). A causa de l'alta densitat cel·lular, la centrifugació ha estat la tècnica preferida per a la clarificació primària durant dècades. Tanmateix, els processos de membrana semblen ser una alternativa molt atractiva perquè l'escalabilitat és fàcil de definir.
Els filtres profunds s'han utilitzat eficaçment en el procés aigües avall de partícules semblants a rotavirus de tres capes. A nivell de laboratori, sovint s'utilitza el mètode d'ultracentrifugació del gradient de densitat de CsCl per purificar aquestes partícules complexes. Els investigadors van avaluar no només l'etapa de clarificació del filtre profund, sinó també tot el procés aigües avall (escissió de Triton X-100 i filtració profunda, seguida d'ultrafiltració i exclusió de la mida de les partícules). Els resultats mostren que el rendiment del gradient de densitat de CsCl pot arribar al 37%.
El mètode ultracentrífug és d'aproximadament un 10%. Com a altre exemple, es van utilitzar fibres buides de 0,45 μm i fibres de diàmetre fi de 500 kDa per recuperar i concentrar partícules semblants al VIH produïdes a les cèl·lules d'insectes. En aquest estudi, es va optimitzar la força de tall de les fibres buides en funció de la integritat cel·lular. Resultats Es va establir un procés de baixa força de cisalla per substituir l'ultracentrifugació amb gradient de sucre de taula.
El procés té el potencial d'aplicar-se a la producció en massa. Els filtres profunds també s'han utilitzat amb èxit en la producció de virus adenoassociats recombinants. La lisi cel·lular es va realitzar amb un bloqueig cel·lular mecànic de dos pistons, seguit d'un tractament amb nucleases. En l'etapa de clarificació, es va utilitzar un element de filtre de fibra de vidre d'1,2 μm, seguit de dues capes de PES hidròfil 0.8μm i PES hidròfil 0.2μm. Els filtres de mida proporcional s'utilitzen per a lots de procés des de mides més petites fins a 200 L. Els filtres profunds s'han utilitzat amb èxit, i també s'ha informat que les classificacions TFF amb pel·lícules planes o fibres buides de 0,2 µm o 0,45 µm són molt efectives.
L'estudi de Tecnologica (IBET) a l'Institut Oeiras de Biologia Experimental de Portugal va utilitzar NFF per aclarir el VLP de l'hepatitis C expressat per baculovirus sense centrifugació. Els filtres de polipropilè de classificació nominal (10,5,0,6 i 0,3μm) s'utilitzen per aclarir la recol·lecció de VLP. Els mateixos filtres amb valors de porus de 0,6μm i 0,3μm s'utilitzen per a la filtració als centres de recol·lecció VLP. Tots els filtrats estudiats es van provar per a les taxes de recuperació de HCV-VLP i es van comparar els mètodes de filtració recomanats. Els resultats es mostren a la taula 4.
Els resultats van mostrar que el filtre de 5 μm-0,3μm va tenir la recuperació de producte més alta (100%) per a l'alimentació VLP d'hepatitis C collida directament. El filtre de polipropilè de 0,6 μm va tenir la recuperació de producte més alta (82%) per a l'alimentació central i l'eliminació d'ADN de la cèl·lula hoste va ser d'aproximadament el 70%.
2.2.1.4 Partícules semblants a virus produïdes en sistemes bacterians o llevats
El tipus de mètode de clarificació de les vacunes VLP expressades en sistemes bacterians o de llevats depèn de l'alliberament de VLP als mediadors extracel·lulars. Si els VLP no es poden secretar de manera eficaç, es pot requerir la lisi cel·lular o altres passos d'extracció abans del pas real de clarificació. Si bé aquest és l'estàndard d'or en la indústria de la clarificació de proteïnes, la centrifugació (continua o per lots) expressada en sistemes basats en bacteris o llevats, més recentment, els processos de membrana s'han convertit en una alternativa molt atractiva per la seva facilitat d'escalabilitat i compatibilitat amb els d'un sol ús. tractaments.
Richter i Topell expliquen l'ús de la centrifugació, TFF o una combinació d'ambdues quan es preparen VLP produïts en E. coli clarificada. En el seu treball, es van utilitzar membranes TFF de 0,45 m per diluir i clarificar els homogeneïtats d'E. coli a una temperatura de 5 graus. També assenyalen que el TFF basat en membrana és adequat per manejar collites d'alta viscositat, preferiblement utilitzant unitats TFF amb configuracions de canal obert.
La clarificació centrífuga també s'ha avaluat com a alternativa a TFF. En aquest cas, l'homogeneïtat resultant no es va diluir i es va centrifugar a 4 graus durant 105 minuts, 10000g. Sense transferir el recobriment suau, el sobrenedant es va abocar de les partícules i es va tornar a centrifugar a 4 graus i 10.000 g durant 60 min. A continuació, es va eliminar el sobrenedant de les partícules presents, es va diluir amb tampó EB (43,89 mM Tris HCl, 6,11 mM Tris Base, 5,0 mM EDTA, 10% (v/v) Triton X-100) 1:2 i es va filtrar en un dispositiu de filtre estèril de 0,22 m. Processament posterior. El procés d'ampliació per a la producció d'aquesta vacuna VLP en E. coli a escala de 800 L també es va aclarir mitjançant la combinació de centrifugació i TFF.
La vacuna recombinant contra l'hepatitis E HEV 239 ha estat autoritzada a la Xina per immunitzar adults de 16 anys o més. Els antígens de la vacuna (VLP) s'expressen a E. coli i s'ha demostrat que l'ampliació del procés de producció d'antigen és a una escala de 50L. El producte es va extreure mitjançant el craqueig d'E. coli i els cossos d'inclusió es van separar dels fragments cel·lulars mitjançant un rentat intens amb un tampó que contenia un 2% de Triton X-100 i després es van dissoldre amb un homogeneïtzador d'urea 4 M. TFF aclareix el VLP del virus del papil·loma humà produït a Saccharomyces cerevisiae (15L). El lisat cel·lular tractat amb nucleasa es va aclarir mitjançant microfiltració de flux creuat en mode de transfiltració mitjançant un filtre de fibra buida de 0, 65 μm. El mateix procés s'utilitza en la producció de vacunes. Tot i que només un grapat de vacunes basades en VLP han assolit l'escala comercial, hi ha diverses vacunes basades en VLP en desenvolupament, la majoria de les quals s'aclareixen mitjançant la tecnologia de centrifugació o de membrana.
Limitats per la influència de l'espai, compartirem la segona meitat del contingut en el proper capítol. En el proper article, compartirem alguns casos d'aclariment de vacunes i l'ús de components de membrana rellevants.
Com a primera empresa del circuit de localització, Guidling Technology ha acumulat una experiència rellevant suficient en la clarificació de vacunes. Guidling Technology és una empresa de desenvolupament i producció centrada en el cultiu, purificació i separació de productes biofarmacèutics i cel·lulars. Els productes s'utilitzen àmpliament en biomedicina, diagnòstic, filtració de fluids industrials, detecció, clarificació, purificació i procés de concentració; Guidling ha desenvolupat amb èxit un tub de centrífuga d'ultrafiltració, un casset de membrana d'ultrafiltració/microfiltració, un filtre d'eliminació de virus, un dispositiu de filtre de flux tangencial, una pila de membrana profunda, etc., que compleixen plenament els escenaris d'aplicació del cultiu biofarmacèutic i cel·lular.
Les nostres membranes i filtres de membrana s'utilitzen àmpliament en concentració, extracció i separació de prefiltració, microfiltració, ultrafiltració i nanofiltració. La nostra àmplia gamma de línies de productes, des de petites filtracions de laboratori d'un sol ús fins a sistemes de filtració de tipus de producció, proves d'esterilitat, fermentació, cultiu cel·lular i molt més, poden satisfer les necessitats de prova i producció.