Procés de concentració d'ultrafiltració/diafiltració aigües avall: com prevenir eficaçment la penetració i la pèrdua de proteïnes objectiu
Procés de concentració d'ultrafiltració/diafiltració aigües avall: com prevenir eficaçment la penetració i la pèrdua de proteïnes diana
En els processos de purificació aigües avall de proteïnes recombinants, productes sanguinis i altres productes biològics, la ultrafiltració/diafiltració (UF/DF) s'utilitza per a la concentració de matèries primeres, l'intercanvi de tampó i l'eliminació de sals i impureses de molècules petites-. La separació s'aconsegueix basant-se en el tamisat de la membrana: les molècules grans com els anticossos monoclonals (mAb) són retinguts per la membrana, mentre que les sals, les endotoxines, les proteïnes de cèl·lules hostes lliures (HCP) i altres impureses de molècules petites-permeten la membrana i s'eliminen al permeat. Durant l'escalada del procés-, la pèrdua de proteïna objectiu a través de la membrana es pot produir fàcilment, reduint directament el rendiment i augmentant els costos del lot. En algunes condicions de funcionament, es pot detectar proteïnes al permeat, cosa que requereix una determinació ràpida de si els components filtrats són mAb objectiu intactes, agregats degradats/fragmentats o proteïnes de cèl·lules hostes. Aquest article es divideix en dues parts principals: revisa els enfocaments tradicionals de-control de processos i, en combinació amb Design of Experiments (DOE), estableix una finestra de procés sòlida, recolzada per diversos mètodes analítics per determinar la identitat de les proteïnes detectades al permeat.
I. Causes clau de la penetració de proteïnes diana a través de la membrana durant UF/DF
1. Pressió transmembrana excessiva (TMP)
Quan la diferència de pressió a través de la membrana és massa alta, l'arrossegament del dissolvent es millora, forçant una mica de proteïna monomèrica al permeat. Durant l'augment d'escala, el dipòsit d'alimentació conté un volum més gran de material i les fluctuacions de pressió a la canonada són més pronunciades, cosa que fa que la sobrepressió transitòria sigui més probable que a escala de laboratori.
2. Caudal tangencial inadequat
Si el cabal és massa baix, es forma una capa densa de concentració-polarització a la superfície de la membrana i la concentració local de proteïnes pot superar el llindar de tolerància de la membrana. Si el cabal és massa alt, l'estrès de cisalla pot provocar una escissió estructural del mAb, generant fragments de proteïnes més petits que poden passar lliurement pels porus de la membrana.
3. Concentració de proteïnes excessivament alta a la matèria primera
Quan la concentració de proteïnes a l'alimentació és massa alta, la proteïna s'acumula a la superfície de la membrana i es pot transportar alguna proteïna monomèrica al permeat. Aquest és un problema comú en la producció a gran-escala.
4. pH o conductivitat fora del rang del procés
Els canvis en les característiques de càrrega de la proteïna poden reduir el seu radi d'hidratació i la mida aparent de les partícules, donant lloc a una penetració anormal de la membrana.
5. Envelliment del casset de la membrana, flux difusiu elevat o precondicionament insuficient-
Els defectes físics del casset de membrana poden provocar directament fuites de proteïnes i representar un risc relacionat amb l'equip-. El CIP repetit amb solucions fortament alcalines pot danyar gradualment el material de la membrana de polietersulfona (PES).
6. Volum de diafiltració excessiu
Durant la diafiltració prolongada, el rentat continu amb dissolvent pot eliminar gradualment petites quantitats de proteïna monomèrica.
II. Mesures pràctiques tradicionals per prevenir la penetració i la pèrdua de proteïnes diana
(A) Control dels paràmetres del procés
1. Control de la pressió transmembrana (TMP)
Definiu un límit d'advertència de pressió superior i establiu alarmes d'enclavament per evitar impactes transitoris d'alta-pressió a la capa de membrana. Després de determinar els paràmetres de referència a petita escala, reduïu la pressió operativa segura durant la producció a escala-i reserveu un rang de tolerància de procés adequat.
2. Optimitzar el flux creuat
Establir una capa límit estable i reduir la polarització de la concentració a la superfície de la membrana mitjançant el flux creuat, minimitzant així l'acumulació de proteïnes a la superfície de la membrana a la font.
3. Limiteu la concentració final després de la concentració
Definir un límit de concentració basat en les propietats fisicoquímiques de la proteïna i evitar una concentració excessiva de pinsos. Per als mAb, la concentració final de rutina generalment no supera els 50 mg/mL; per a alguns mAb propensos a l'agregació-, la concentració s'hauria de reduir encara més.
4. Controlar el pH i la conductivitat de l'alimentació
Mantenir una mida de partícula hidratada estable de la proteïna i evitar la contracció molecular causada per alteracions de la força àcid/base o{0}}iònica.
(B) Equips i controls operatius
1. Realitzeu proves d'integritat del casset de membrana abans de cada lot
Feu una prova de-punt de bombolla abans de la producció de cada lot per identificar les fibres de membrana trencades. Els cassets de membrana danyats s'han de descartar immediatament per evitar la fuita contínua de proteïnes.
2. Estandarditzar el procediment de neteja CIP
Controlar la concentració de NaOH i el temps de contacte. Després d'una neteja fortament alcalina, equilibreu completament el material de la membrana per reduir el risc de deformació dels porus de la membrana.
3. Utilitzar la diafiltració per etapes
Utilitzeu un intercanvi de tampó de gran-volum durant la fase inicial per eliminar les sals i alentiu el cabal de diafiltració a mesura que s'acosta el punt final per reduir l'arrossegament i la pèrdua de proteïnes.
III. Establiment d'un espai de disseny de processos mitjançant DOE (Caracterització de processos QbD; aplicable a la presentació IND)
1. Cribratge de factors
Pantalla de cinc paràmetres clau del procés UF/DF (P): pressió transmembrana, cabal d'alimentació, concentració inicial de proteïnes, pH de l'alimentació i temperatura de funcionament.
Variables de resposta: rendiment retingut, contingut de proteïnes al permeat, flux de membrana i percentatge d'agregats d'alt pes-molecular-.
Mitjançant l'anàlisi de significació, identifiqueu els factors clau que contribueixen a la fuita de proteïnes.
2. Modelització de superfícies de resposta
Seleccioneu els quatre paràmetres amb més significació per construir una superfície de resposta i analitzar les interaccions entre paràmetres. En moltes condicions de funcionament, un únic paràmetre pot romandre dins del seu rang qualificat, mentre que la combinació de dos paràmetres pot donar lloc a la penetració de proteïnes. Aquests efectes d'interacció no es poden identificar mitjançant experiments tradicionals d'un-factor-a la vegada--. A partir del model, definiu un espai de disseny operable. Mentre els paràmetres del procés es mantinguin dins d'aquest rang, es pot garantir una retenció efectiva de proteïnes mentre s'eliminen les impureses per diafiltració.
3. Repte-del pitjor cas (necessari per a la caracterització del procés)
Seleccioneu els paràmetres del procés als extrems dels límits operatius per simular la variabilitat de fabricació: TMP màxim, velocitat de flux creuat mínim i concentració de proteïnes límit-superior. Verifiqueu que, fins i tot en condicions de funcionament extremes, no es produeixi-pèrdua de proteïna objectiu a gran escala, complint així els requisits de revisió CMC.
IV. Múltiples mètodes analítics per identificar proteïnes detectades al permeat i distingir mAb objectiu, fragments de degradació i HCP
A partir de l'eficiència analítica, el cost i els escenaris d'enviament reglamentari, els mètodes es poden dividir en dues categories: cribratge ràpid i proves de confirmació. Els mètodes ràpids s'han de prioritzar per a la vigilància rutinària del procés; quan es produeixen desviacions anormals, s'han d'utilitzar mètodes d'identificació precisos.
1. Espectrofotometria UV (detecció ràpida en línia; preferida per a la supervisió habitual de la botiga-)
Recollir el permeat i mesurar la seva absorbància A280. Això només pot determinar si la proteïna està present al permeat i no pot distingir les espècies de proteïnes. S'utilitza principalment per a la supervisió de processos de rutina. Un valor d'A280 que augmenta contínuament indica un empitjorament de la fuita de proteïnes i requereix la suspensió immediata de la diafiltració i la investigació del procés.
2. Electroforesi SDS-PAGE (métode d'identificació qualitatiu més utilitzat)
Utilitzeu electroforesis reductora i no{0}}reductora i compareu les posicions de la banda amb les del mAb objectiu a la matèria primera:
1) Si la posició de la banda és completament coherent amb el mAb objectiu, el mAb intacte ha impregnat la membrana.
2) Si apareixen bandes de menor pes-molecular-, la proteïna ha patit una escissió hidrolítica, generant fragments de mAb.
3) Si les bandes estan escampades amb diverses bandes diverses, la majoria són proteïnes de cèl·lules hostes (HCP) de cèl·lules hostes d'E. coli/CHO en lloc del producte objectiu.
3. Cromatografia d'exclusió de -alt rendiment-(HPSEC)
Separeu els components segons la mida molecular i compareu els seus temps d'elució amb els del cromatograma de la matèria primera:
- Un pic principal amb el mateix temps de retenció que el mAb indica una proteïna objectiu intacta.
- Un pic que elueix abans indica agregats/fragments de gran pes-molecular-.
- Un pic que elueix més tard indica fragments de degradació de baix pes-molecular-.
- L'absència d'un pic principal característic indica proteïnes d'impuresa HCP.
Aquest mètode pot proporcionar dades quantitatives i es pot incloure als informes d'investigació de desviacions del procés; té una gran acceptació en els materials de presentació clínica.
4. Prova del kit ELISA de proteïnes de la cèl·lula host-HCP
Si es detecta proteïna al permeat, el resultat ELISA s'eleva i l'HPSEC no mostra cap pic de mAb característic, bàsicament es pot determinar que el material filtrat és proteïna de la cèl·lula host-CHO. Això indica una eliminació incompleta d'impureses durant la purificació aigües amunt; les impureses s'estan rentant durant l'etapa UF/DF i no representen pèrdua de producte.
5. Verificació per cromatografia d'afinitat (cromatografia de proteïnes A)
La proteïna A s'uneix específicament a la regió Fc dels mAb. Carregueu la mostra de permeat a la columna: l'aparició d'un pic d'elució característic indica la presència d'anticossos diana intactes; l'absència d'un pic d'elució demostra que les proteïnes del permeat són totes proteïnes impureses.
6. Espectrometria de masses (LC-MS) (traçabilitat en profunditat; utilitzada per a la investigació de desviacions importants del procés)
LC-MS pot analitzar directament la seqüència d'aminoàcids i determinar amb precisió l'origen de la proteïna. S'utilitza principalment per a la investigació de desviacions difícils o inusuals i no s'utilitza com a rutina en la-prova de control del procés.
V. Accions correctores corresponents a diferents resultats analítics
1. MAb diana intacte detectat al permeat
Reduir la pressió transmembrana i la concentració final després de la concentració; reduir l'interval de funcionament del procés en funció dels resultats del DOE; i comproveu la integritat del casset de membrana.
2. Fragments de degradació d'anticossos detectats en el permeat
Investigar l'esforç de cisalla al llarg del procés i els extrems de pH; optimitzar el pas d'inactivació viral aigües amunt per reduir la divisió de proteïnes.
3. Només es detecten proteïnes d'impuresa HCP al permeat
No cal ajustar els paràmetres UF/DF. Seguiu el problema fins als passos anteriors de la cromatografia i milloreu l'eliminació d'impureses durant la cromatografia d'afinitat i d'intercanvi d'ions-.
VI. Resum
Per evitar les fuites de proteïnes durant l'UF/DF, el control del procés tradicional es basa en l'experiència històrica per definir paràmetres puntuals individuals, que només poden abordar adequadament la producció estable a petita-escala. Per garantir un rendiment estable durant l'escala-de procés gradual, s'ha d'utilitzar la caracterització del procés-basada en el DOE per establir un espai de disseny de processos amb una tolerància suficient. El control de paràmetres-basat en intervals pot compensar la variabilitat de fabricació. Un cop detectada la proteïna al permeat, un simple sistema de detecció UV pot proporcionar un avís inicial, seguit d'electroforesi, HPSEC i ELISA per a la traçabilitat i la identificació. Això permet una diferenciació precisa entre el producte objectiu i les impureses de la cèl·lula-amfitrió, permetent la investigació de la causa arrel-orientada i les accions correctores. Aquest és també un component de recerca estandarditzat que actualment s'inclou a la documentació CMC per als projectes mAb.
