Breu discussió de diversos mètodes únics de fibra buida en la purificació del cos d'inclusió
Els cossos d'inclusió (IB) són partícules de proteïnes insolubles d'alta densitat embolicades en membranes que es formen quan s'expressen gens estrangers en cèl·lules procariotes, especialment a Escherichia coli. Quan s'observa al microscopi, IB és una regió d'alta refracció, que és evidentment diferent d'altres components del citoplasma.
La formació del cos d'inclusió és relativament complexa, relacionada amb la taxa de producció de proteïnes al citoplasma, la concentració de pèptids recentment generats és alta i no hi ha prou temps per plegar-se per formar agregats de proteïnes amorfes. Els cossos d'inclusió estan formats bàsicament per proteïnes, més del 50% de les quals són productes clonats. L'estructura primària d'aquests productes és completament correcta, però la configuració tridimensional és incorrecta, de manera que no hi ha activitat biològica. La mida del cos d'inclusió és de 0,5-1μm, insoluble en aigua, només soluble en desnaturalitzants com la urea, el clorhidrat de guanidina, etc.
A E. coli, els cossos d'inclusió poden ocórrer en dues ubicacions de la cèl·lula: el citoplasma i el citoplasma perifèric. La ubicació i les característiques dels cossos d'inclusió a la cèl·lula depenen de com s'expressen les proteïnes.
Les inclusions al citoplasma d'E. coli generalment oscil·len en diàmetre de {{0}},2 a 1,5μm, i diferents proteïnes tenen diferents diàmetres, com ara la mida de l'interferó és de 0,811μm i la mida de prorennet és 1.281μm. En alguns casos, el diàmetre d'alguns cossos d'inclusió és més gran que el diàmetre d'E. coli, cosa que dóna a E. coli una protuberància. En general, una cèl·lula només té un cos d'inclusió.
Purificació corporal d'inclusió
El procés de purificació del cos d'inclusió és generalment:
Trituració cel·lular:
La tecnologia general de trituració cel·lular és: trituració de teixits d'alta velocitat, homogeneïtzació de l'homogeneïtzador de vidre, tractament ultrasònic, mètode de congelació-descongelació repetida, tractament químic (generalment utilitzant tractament de lisozima).
Inclusió de rentat corporal:
Els cossos d'inclusió són partícules sòlides inactives formades per aglutinació intracel·lular de proteïnes expressades per bacteris, que solen existir en forma amorfa i insoluble. En el cos d'inclusió, la veritable proteïna objectiu només representa al voltant del 50%, i la resta conté lípids, lipopolisacàrids, àcids nucleics i heteroproteïnes, que s'uneixen al cos d'inclusió i afecten la renaturalització de la proteïna del cos d'inclusió. Per tant, el rentat abans de la desnaturalització és un pas molt necessari.
A més, el rentat dels cossos d'inclusió és útil per augmentar el rendiment de replegament de proteïnes recombinants. En eliminar les impureses, es poden reduir els obstacles en el procés de renaturalització, de manera que la proteïna es pot plegar i muntar correctament de manera més eficient, millorant així l'activitat i la funció de la proteïna.
El rentat s'utilitza habitualment menys de l'1% del detergent neutre, com ara Tween, Triton, Urea i NP40 més EDTA i agents reductors 2-mercaptotreitol (DTT), -mercaptoetanol repetit moltes vegades, perquè la capacitat de rentat del detergent es millora amb l'augment de la força iònica de la solució, en el rentat dels cossos d'inclusió es pot afegir NaCl per augmentar la força iònica.
Els cossos d'inclusió es poden utilitzar per eliminar altres components de la solució de descomposició cel·lular mitjançant centrifugació o filtració, ambdós que aprofiten les diferents propietats físiques dels cossos d'inclusió.
Centrifugació:
Les proteïnes del cos d'inclusió són molt més denses que el mateix volum de fragments cel·lulars, de manera que el cos d'inclusió es pot separar de la resta de la cèl·lula mitjançant la centrifugació. La centrifugació contínua és l'operació més utilitzada per a l'obtenció de cossos d'inclusió en la producció industrial. Com que la densitat dels fragments cel·lulars és menor que la del cos d'inclusió, la velocitat de sedimentació és menor que la del cos d'inclusió. La suspensió i la centrifugació contínues poden centrifugar la major part del cos d'inclusió, mentre que els fragments cel·lulars s'eliminen gradualment.
Filtració (filtració de flux tangencial): a causa de les diferents mides moleculars dels cossos d'inclusió i de les proteïnes solubles, es pot utilitzar el mètode de filtració, que pot reduir els costos operatius i facilitar la seva ampliació. La filtració de flux tangencial (TFF) és impulsada per la diferència de pressió transmembrana. Les substàncies i les impureses més petites que la mida dels porus de la membrana passen a través de la membrana, mentre que les impureses com les cèl·lules amb partícules més grans queden atrapades. L'obertura de la membrana que s'utilitza generalment per al rentat de filtració és de 0,1 μm. La microfiltració de flux tangencial de fibra buida pot tractar directament un alt contingut sòlid de material líquid, menys passos, operació senzilla, la membrana es pot utilitzar repetidament mitjançant la neteja, reduint la inversió en equips i els costos operatius, d'acord amb els requisits de la producció automatitzada modular.
El següent és un cas d'aplicació per al rentat del cos d'inclusió mitjançant columnes de fibra buida Guidling.
Hem utilitzat fibra buida de 94 cm2 0.1-0,45μm per concentrar 250 ml de líquid (pes molecular de la proteïna objectiu 17 kd). En tot el procés de rentat, es va investigar la taxa de recuperació de la proteïna diana i l'esgotament del flux de membrana.
0-71min és el procés de concentració, 71-224min és el procés de rentat i filtració. Durant tot el procés de microfiltració, el TMP va augmentar gradualment, la velocitat d'entrada de líquid es va mantenir sense canvis i el flux mitjà de material va ser de 12LMH.
Els resultats van mostrar que la proteïna objectiu estava completament atrapada i la taxa de recuperació de la proteïna objectiu era superior al 90%. Les columnes guidling de fibra buida són estables i adequades per a aquesta aplicació.
Dissolució del cos d'inclusió:
Els cossos d'inclusió generalment es dissolen sota la condició d'un agent desnaturalitzant urea o clorhidrat de guanidina, i les proteïnes del cos d'inclusió dissolts es desnaturalitzen completament, és a dir, tret que es conserven l'estructura primària i els enllaços covalents, es destrueixen tots els enllaços d'hidrogen i els enllaços hidròfobs i els hidrofòbics. les cadenes laterals estan completament exposades.
La urea i el clorhidrat de guanidina són desnaturalitzants de força mitjana, que s'eliminen fàcilment per diàlisi i ultrafiltració. La concentració general d'urea 8-10M, clorhidrat de guanidina 6-8M. La dissolució de la urea té els avantatges de la no ionització, neutral, de baix cost, l'eliminació de proteïnes després de la renaturació no provocarà una gran quantitat de precipitació de proteïnes, i els cossos d'inclusió dissolts es poden purificar mitjançant una varietat de mètodes cromatogràfics, de manera que s'ha utilitzat àmpliament. .
Replegament de proteïnes corporals d'inclusió:
La proteïna recombinant dissolta s'ha de plegar correctament per formar una proteïna funcional. Les tècniques de renaturació inclouen la dilució de la solució de proteïnes a gairebé neutre, l'eliminació del desnaturalitzant, la renaturació en columna i la cromatografia de filtració en gel. Entre ells, diluir la solució de proteïnes a gairebé neutre i eliminar el desnaturalitzant és un mètode clàssic comú de renaturació, especialment el mètode de renaturació per dilució té la taxa d'utilització més alta.
Eliminació desnaturalitzant:
Diàlisi: l'avantatge és que el volum no augmenta i la taxa d'eliminació del desnaturalitzant es controla reduint gradualment la concentració de líquid permeable extern, però triga molt de temps i és fàcil formar agregats de proteïnes inactives, que no són adequats per a operació a gran escala i no es pot aplicar a l'escala de producció.
Ultrafiltració (TFF): fàcil de controlar la velocitat de la diàlisi, ja sigui en recerca i desenvolupament, prova pilot o producció, pot eliminar desnaturalitzants (canvi de líquid + concentració) mitjançant ultrafiltració (TFF).
Purificació de proteïnes corporals d'inclusió:
Els mètodes de purificació de proteïnes després de la renaturació són similars als de purificació de proteïnes solubles, és a dir, cromatografia d'intercanvi iònic, cromatografia de filtració en gel, cromatografia d'afinitat, precipitació de sal amb sulfat d'amoni, etc.
Els cossos d'inclusió no tenen activitat biològica, no cal preocupar-se per la pèrdua d'activitat proteica, i grans quantitats d'expressió no conduiran a la mort cel·lular i maximitzaran la resistència a l'atac de la proteasa. La fibra buida Jiuling es pot aplicar de manera flexible en el procés de purificació aigües avall dels cossos d'inclusió. En el pas de rentat del cos d'inclusió, un rendiment excel·lent, en comparació amb el rentat centrífug, l'ús de fibra buida de microfiltració de nou edat per al rentat de filtració de flux tangencial pot escurçar molt el temps del procés i la taxa de recuperació general pot arribar a més del 90%. La fibra buida Jiuling també es pot utilitzar en l'etapa de renaturació de proteïnes dels cossos d'inclusió. La terbolesa del líquid d'alimentació filtrat per fibra buida de microfiltració es reduirà significativament i la taxa de recuperació de proteïnes és alta; L'ús de fibra buida d'ultrafiltració no només pot eliminar els desnaturalitzants, sinó que també escurça el temps de càrrega de la mostra cromatogràfica, per estalviar temps, reduir el volum de farciment i reduir el cost de producció. La taxa de recuperació de la fibra buida de microfiltració/ultrafiltració varia amb diferents materials i la taxa de recuperació general pot arribar al 90-95%.
Guidling Technology us dóna la benvinguda a sol·licitar kits de prova per a revisions relacionades.
Sobre Guidling
Guidling Technology és una empresa nacional d'alta tecnologia centrada en productes biofarmacèutics, cultiu cel·lular, purificació i concentració de biomedicina, diagnòstic i fluids industrials. Hem desenvolupat amb èxit dispositius de filtre centrífug, cassets d'ultrafiltració i microfiltració, filtre de virus, sistema TFF, filtre de profunditat, fibra buida, etc. Que compleixen plenament els escenaris d'aplicació de biofarmacèutics, cultiu cel·lular, etc. Les nostres membranes i filtres de membrana s'utilitzen àmpliament en concentració, extracció i separació de prefiltració, microfiltració, ultrafiltració i nanofiltració. Les nostres moltes línies de productes, des de la petita filtració de laboratori d'un sol ús fins a sistemes de filtració de producció, proves d'esterilitat, fermentació, cultiu cel·lular i més, satisfan les necessitats de proves i producció. Guidling Technology està desitjant cooperar amb vosaltres!