Tecnologia d'inactivació i eliminació de virus de productes sanguinis
Els productes sanguinis són "components de proteïnes plasmàtiques o components de cèl·lules sanguínies, com ara albúmina de sang humana, immunoglobulina humana, factor de coagulació humà (natural o recombinant), concentrat de glòbuls vermells, etc., separats del plasma humà sa o plasma humà específicament immune, purificat o fet amb tecnologia d'ADN recombinant, per al diagnòstic, la teràpia o la immunoprofilaxi passiva". Els productes sanguinis tenen un paper important en l'emergència mèdica, el rescat de lesions de guerra i la prevenció i el tractament d'algunes malalties específiques.
Antecedents normatius
Les pràctiques de garantia de seguretat han de garantir que el medicament final sigui segur per als reguladors i, en última instància, per als pacients i el públic. A la dècada de 1990, la Conferència Internacional de Coordinació (ICH 1998) va publicar "Q5A: Viral Safety Assessment of Biotechnological products of Human or animal Origin Cell lines" (Q5A: Viral Safety Assessment), establint un estàndard mundial per a la seguretat viral.
ICH Q5A descriu un esquema de diversos nivells per provar i validar la validació per aconseguir aquest objectiu. El programa de proves se centra en la recol·lecció de bancs cel·lulars, matèries primeres i bioreactors, complementat amb l'anàlisi del risc del producte. A més de les proves, ICH Q5A requereix que la descontaminació aigües avall s'avaluï com a mesura de seguretat quan no es detectin contaminants aigües amunt. La verificació de l'autorització garanteix que si algun virus eludeix el règim de proves, es pot eliminar i/o desactivar abans d'acabar en el producte farmacèutic final.
Antecedents del programa general de seguretat de virus
En la fabricació (o bioprocessament) de biotecnologia moderna, normalment hi ha tres o quatre operacions unitats en tota la seqüència purificada, capaços d'eliminar o inactivar el virus. Això inclou determinats passos cromatogràfics (com la proteïna A o l'intercanvi d'anions), cultiu de pH baix o detergents i filtres de retenció de virus. No tots aquests passos eliminaran o desactivaran de manera efectiva tots els virus.
Per exemple, el cultiu de pH baix sol ser ineficaç per a la inactivació de virus sense embolcall, però funciona bé per a la inactivació de virus amb embolcall. En determinades condicions de funcionament, és possible que la columna d'intercanvi d'anions no pugui unir i eliminar virus isoelèctrics neutres del flux de producte, però és eficaç contra virus àcids.
Es tracta d'una combinació de tres o quatre operacions d'unitats independents i ortogonals que, en conjunt, garanteixen la seguretat del virus dels productes biotecnològics.
En general s'assumeix que un pas de processament robust, eficient i fiable serà capaç d'eliminar o inactivar un gran nombre de virus (normalment es defineix com a 4 log10 o més, on el valor de reducció de registre o LRV es calcula com el log10 del total). nombre de virus a l'entrada dividit pel nombre total de virus a la sortida). Tanmateix, el LRV no es pot utilitzar com a mesura absoluta única de l'efectivitat d'un pas. Les dades poden ser preliminars. És fàcil de modelar, relativament insensible als canvis en les condicions del procés i eficaç contra una sèrie de virus (OMS 2004).
La filtració viral és àmpliament reconeguda com un pas de procés tan potent i eficaç i és un component clau de l'estratègia global per minimitzar el risc de partícules virals exògenes i endògenes durant la fabricació de productes biotecnològics.
Els filtres virals sovint funcionen mitjançant mecanismes de retenció forts basats en la mida. A partir d'aquest potent mecanisme d'acció, és més probable que els filtres virals que els passos cromatogràfics proporcionin una retenció viral previsible per a una sèrie de virus. Això es deu al fet que és menys probable que el filtre es vegi afectat per les diferències en les propietats fisicoquímiques de diferents virus i les interaccions virus-resina regulades per les condicions de funcionament. Per tant, el pas de filtració viral s'utilitza habitualment en processos de purificació de proteïnes terapèutiques recombinants ben dissenyats (EMEA 1996), que també s'ha demostrat que tenen un rendiment robust a la indústria de processament de plasma.
Tanmateix, els productes sanguinis són com una arma de doble tall, que no només salva milers de vides, sinó que també té la possibilitat de propagar malalties i suposar una amenaça per a la salut humana. Segons les estadístiques, entre 1977 i 1984, almenys 30,000 receptors de sang als Estats Units van rebre sang infectada amb el virus de la sida. El 1985, 1.200 de cada 3,000 hemofílics a França es van infectar amb la sida mitjançant transfusions de sang o productes sanguinis.
Segons l'Organització Mundial de la Salut, entre el 5% i el 10% de les infeccions de sida a tot el món són causades per transfusions de sang o productes sanguinis infectats per la sida. El primer cas de sida a la Xina es va infectar mitjançant l'ús de productes sanguinis importats infectats amb el virus de la sida. A més, també s'ha informat de la transmissió d'hepatitis B i C per transfusió de sang i productes sanguinis.
1. Principals virus transmesos per hemoderivats i les seves característiques
Hi ha molts tipus de virus que es transmeten a través de la sang i els productes sanguinis, tal com es mostra a la taula 1. Entre ells, el VIH, el VHB i el VHC han estat preocupats pels cercles mèdics nacionals i estrangers a causa de la seva alta taxa d'infecció i greus danys.
Com que la sang i els productes sanguinis tenen la possibilitat de propagar virus, ha afectat greument la seva aplicació en la prevenció i tractament de malalties. Per tant, en la producció de productes sanguinis, cal afegir processos d'inactivació i eliminació de virus per garantir la seguretat dels productes sanguinis.
2. Principals mètodes d'inactivació i eliminació de virus
Per garantir la seguretat dels productes sanguinis, a més de la selecció de donants de sang, la immunització quan sigui possible i les proves estrictes de la sang recollida i altres mesures, la inactivació i eliminació del tractament amb virus dels productes sanguinis és un enllaç important per garantir la seguretat de la transfusió de sang. A continuació es descriuen amb detall diversos mètodes eficaços i utilitzats habitualment per inactivar i eliminar virus.
I. Mètodes d'inactivació de virus
1. Mètode Pasteur
La base teòrica d'aquest mètode és que la taxa de destrucció de l'estructura del virus és molt superior a la de l'estructura de la proteïna mitjançant la selecció de la temperatura i el temps d'acció. Gairebé 50 anys de resultats d'ús clínic i experiments recents amb animals han confirmat que l'albúmina en solució després de 60 graus, 10 h de tractament d'escalfament, és a dir, la desinfecció Pasteur, no només pot inactivar el VHB, sinó també inactivar el VHC i el VIH, fent que l'albúmina sigui la més fiable. producte sanguini amb seguretat viral.
Recentment, el procés de Pasteur s'ha estès a la producció d'IVIG, FVI, FIX, fibrinogen i altres productes. Bridonnccu et al. va afegir aquest procés d'inactivació del virus al procés IVIG de producció d'etanol a baixa temperatura, és a dir, el mètode Pasteur es va implementar en condicions de no estabilitzador, baixa sal i acidesa, i el títol del virus va disminuir en 5 Log. Simmonds et al. va provar el virus transmès per transfusió (TTV) de preparats concentrats FVⅢ i FIX utilitzats clínicament al Regne Unit i va trobar que la taxa de detecció de TTV de productes sense inactivació del virus Pasteur era del 50% al 75% i la taxa de detecció positiva. de productes després de la inactivació de Pasteur va ser 0.
La taxa positiva de TTV va ser del 27% en 84 pacients amb hemofília al Regne Unit que van utilitzar productes de factor de coagulació no inactivats, mentre que només 1 de 19 pacients que utilitzaven productes de factor de coagulació inactivats per virus va ser positiu, amb una taxa de detecció positiva del 5%. Per tant, el procés d'inactivació del virus és molt eficaç per millorar la seguretat dels productes sanguinis.
2. Dissolvent orgànic combinat amb tensioactiu (mètode S/D)
This method was first established by Horowitz et al., a blood center in New York, the principle is that organic solvents can make lipids fall off the surface of the virus, so that the structure of the virus is destroyed and the infection activity is lost. The common S/D method uses n-butyl triphosphate (TNBP) in combination with different surfactants such as Tine80, Triton X100, and sodium cholate. The effect of S/D method on the inactivation of lipid-coated viruses in blood products has been confirmed. For example, when FI concentrated preparations were treated with 0.3%TNBP and 0.2% sodium cholate at 24℃ for 6 h, the inactivation of HBV and HCV was >4 Log,HIV >4.5 Log, and the inactivation of VSV and Sindbis viruses was >4.5 Log, and the recovery rate of FVIII was >90%. S'ha demostrat que un gran nombre de productes sanguinis inactivats pel mètode S/D s'han demostrat segurs i fiables mitjançant l'aplicació clínica a llarg termini, de manera que s'utilitzen àmpliament. No obstant això, aquest mètode no té cap capacitat d'inactivació contra parvovirus B19, HEV i altres virus no recoberts de lipo.
3. Mètode d'inactivació per calor seca
La inactivació de la calor seca significa que la preparació liofilitzada es tracta per escalfament i el virus es mata per la calor seca. Els mètodes de calor sec que s'utilitzen habitualment són el mètode d'escalfament de 60 graus ~ 80 graus, el mètode d'escalfament de 10~72 h i el mètode de tractament de 80 graus i 72 h. Ja a principis de la dècada de 1980, era útil escalfar la preparació concentrada liofilitzada de FVIII i el complex de protrombina a 60 graus ~ 80 graus durant 10 ~ 72 h. Tanmateix, s'ha demostrat que aquest mètode no pot desactivar completament el VHB, el VHC i el VIH. S'ha demostrat que el tractament tèrmic sec a 80 graus i 72 h és efectiu per inactivar el VHB, el VHC i el VIH. També hi ha hagut informes recents de preparats liofilitzats de factors de coagulació tractats a 100 graus. Xu Jinbo et al van tractar IgG a 100 graus durant 30 minuts i van inactivar el virus de l'estomatitis vesicular 8.2 Log. Algunes persones congelaran el FVIII liofilitzat a 68 graus durant 72 hores, en estat sec i després s'escalfaran a 100 graus durant 0,5 ~ 1 h. Aquest mètode és relativament econòmic.
4. Mètode fotoquímic
This method was first proposed by Matthews et al. The principle is that some photosensitizers have a strong affinity for the surface of the virus and the structure of the viral nucleic acid, and are easily activated under appropriate wavelength of light, thus destroying the structure of the virus in contact with them through photochemical action. The photosensitizers that have been used include: hemacoline derivatives, psoralide derivatives, phenothiazines, phthalocyanines, and cyanine 540, etc. The main feature of this method is that it can be used to inactivate the virus of whole plasma, and the inactivation of the virus of platelet products is the current research focus. Scientists from the Department of Experimental Medicine at the University of California in the United States have screened out a new psoralen derivative S-59 among more than 100 chemical modifications of psoralen. The platelets were irradiated with 150 um S-59 combined with 3 J/cm2 UVA, which could inactivate >6.7 Log of free HIV and >6.6 Registre de cèl·lules unides al VIH i les plaquetes es van mantenir bé després de 7 dies de preservació funcional in vitro, que ha estat aprovada per la FDA per a assaigs clínics.
Entre aquests mètodes, el mètode de desinfecció Pasteur i el mètode S/D estan aprovats per la FDA dels Estats Units i s'utilitzen àmpliament al món. El mètode d'inactivació de calor seca és adequat principalment per a la inactivació de virus de preparats liofilitzats. El mètode fotoquímic té un fort efecte d'inactivació sobre els virus recoberts de lípids i s'ha utilitzat en la inactivació de virus de plasma sencer a Europa, i té àmplies perspectives d'inactivació de virus en components de cèl·lules sanguínies. Tanmateix, tots aquests mètodes tenen les seves pròpies mancances, com que l'esterilització Pasteur no és ideal per a la inactivació d'alguns virus resistents a la calor; El mètode S/D no va poder inactivar efectivament el virus no recobert de lipo. El mètode fotoquímic va danyar significativament l'activitat d'algunes proteïnes plasmàtiques. L'ús clínic actual de les investigacions de seguiment demostra que cap mètode d'inactivació de virus pot garantir que els productes sanguinis estiguin absolutament lliures del risc de transmissió de virus.
I. Procés d'eliminació de virus
En la producció de productes sanguinis, un procés d'inactivació no pot inactivar tots els virus; A més, el virus en si és una proteïna heteròloga, com l'entrada amb el producte produirà reaccions adverses; Al mateix temps, a causa de la limitació del nivell tècnic, encara hi ha virus les característiques dels quals no es troben ni s'entenen, de manera que els mètodes d'inactivació de virus existents no poden garantir l'efecte d'inactivació d'aquests virus. Per tant, la inactivació per si sola no pot garantir la seguretat del producte i s'ha d'eliminar del producte. Així, la tecnologia d'eliminació de virus està rebent cada cop més atenció. A continuació es descriuen breument dos processos d'eliminació de virus d'ús habitual i eficaç.
1. Tecnologia cromatogràfica
La tecnologia cromatogràfica es refereix a l'ús de diversos components i d'afinitat de fase estacionària o diferències d'interacció, per aconseguir la separació de diversos components. Com a tecnologia avançada per a la producció de productes sanguinis, la cromatografia en si té l'efecte d'eliminar virus, especialment la cromatografia d'afinitat i la cromatografia d'intercanvi iònic. Per a la cromatografia d'intercanvi iònic, l'elució té avantatges sobre la penetració en l'eliminació de virus. La taula 2 mostra les estadístiques de dades de la taxa d'eliminació de l'HAV per tecnologia cromatogràfica en el procés de producció d'albúmina per CSL Company a Austràlia. Com es pot veure a la taula 2, la cromatografia d'intercanvi iònic i la filtració en gel són més efectives per eliminar el VHA, amb una taxa d'eliminació total de 10,9 log.
En la producció de FVIII, Baxter Healtheare realitza cromatografia d'immunoafinitat mitjançant gels tractats amb anticossos anti-FVIII, que poden eliminar (4,2±0.1)Log i (5,3±0.9)Log de no -virus recoberts de lípids com PPV i VHA, respectivament.
2. Filtració de nanofilm
Per a alguns virus amb un diàmetre superficial reduït, com el VHA i el parvovirus B19, la filtració de nanomembrana és el mètode d'eliminació més eficaç. Aprofita la diferència de mida entre proteïnes i virus i l'adsorció de virus per la membrana del filtre per aïllar els virus. Es va realitzar un estudi de laboratori al lloc de subministrament de sang de Sanquin als Països Baixos sobre l'eliminació de virus afegint una filtració de nanomembrana Planova 15N d'un sol pas i dues etapes al procés de producció del complex de protrombina. Es va trobar que les taxes d'eliminació del VIH, VHA i altres virus van augmentar en diferents graus després de la filtració de nanomembrana (vegeu la taula 3).
No obstant això, quan aquest mètode s'aplica a la producció industrial es poden produir els problemes següents: en primer lloc, a causa de l'alta viscositat del producte i la presència de proteïnes de gran diàmetre, la mida dels porus de la membrana seleccionada pel filtre no hauria de ser massa petita, limitant així l'eliminació de virus de petit diàmetre com el VHC; En segon lloc, l'estabilitat del control de la mida dels porus de la membrana en el procés de producció del filtre afectarà l'eliminació del virus. En tercer lloc, quan es bloqueja l'obertura de la membrana més petita que el diàmetre de la partícula del virus, el cabal del producte es reduirà, afectant el rendiment. Per tant, la selecció de membranes les propietats i la mida dels porus de les quals siguin adequades a les necessitats dels productes processats és un factor important per determinar si la filtració de nanomembrana pot eliminar virus.
3. Discussió
Sota la premissa de garantir la qualitat de la font de sang, el procés d'inactivació i eliminació del virus és un mitjà important i necessari per garantir la seguretat dels productes sanguinis. L'ús d'un sol procés de virus inactivat no pot garantir absolutament la seguretat dels productes sanguinis. Sobre la base de la tecnologia d'inactivació de virus, es va afegir la tecnologia d'eliminació de virus, com ara la cromatografia i la filtració de nanofilm, la taxa d'eliminació de virus es va augmentar molt i l'efecte d'eliminació i inactivació del virus es va millorar significativament. En l'actualitat, Europa ha proposat clarament que en el procés de producció de productes sanguinis s'ha d'utilitzar almenys una inactivació i eliminació de virus per garantir la seguretat dels productes sanguinis.
A la Xina, la majoria dels fabricants de productes sanguinis només utilitzen un procés de virus inactivat en el procés de producció, com el mètode de desinfecció Pasteur, el mètode S/D, etc., però no utilitzen el procés d'eliminació del virus, que afecta seriosament la qualitat dels productes sanguinis. Amb l'adhesió de la Xina a l'OMC, el procés de producció i els estàndards de qualitat dels productes sanguinis nacionals estaran en línia amb el món, en cas contrari, no pot garantir la quota de mercat nacional existent, però tampoc no pot competir amb productes similars en altres països del món. mercat internacional.
Per tant, els fabricants de productes sanguinis de la Xina han de millorar el procés de producció, reforçar la inactivació i l'eliminació del virus, per tal de garantir plenament la qualitat i la seguretat del producte. Per tant, serà la tendència que els fabricants xinesos de productes sanguinis utilitzin la cromatografia per purificar els productes sanguinis i eliminar virus per garantir la seguretat dels productes sanguinis.
Sobre Guidling
Guidling Technology és una empresa nacional d'alta tecnologia centrada en productes biofarmacèutics, cultiu cel·lular, purificació i concentració de biomedicina, diagnòstic i fluids industrials. Hem desenvolupat amb èxit dispositius de filtre centrífug, cassets d'ultrafiltració i microfiltració, filtre de virus, sistema TFF, filtre de profunditat, fibra buida, etc. Que compleixen plenament els escenaris d'aplicació de biofarmacèutics, cultiu cel·lular, etc. Les nostres membranes i filtres de membrana s'utilitzen àmpliament en concentració, extracció i separació de prefiltració, microfiltració, ultrafiltració i nanofiltració. Les nostres moltes línies de productes, des de la petita filtració de laboratori d'un sol ús fins a sistemes de filtració de producció, proves d'esterilitat, fermentació, cultiu cel·lular i més, satisfan les necessitats de proves i producció. Guidling Technology està desitjant cooperar amb vosaltres!