Comparteix la literatura|Acomiadar -se de la purificació complexa? Un nou mètode tensioactiu TFF + millora l'eficiència i redueix els costos en la producció vectorial AAV

La teràpia gènica es desenvolupa ràpidament, però el seu elevat cost continua sent una barrera important per evitar un accés més ampli al pacient. Entre els motors clau d’aquest cost hi ha el complex procés de producció dels vectors d’Adeno - associat (AAV). Un estudi publicat en biotecnologia i bioenginyeria ha desenvolupat un nou mètode de purificació que combina la filtració de flux tangencial (TFF) amb els tensioactius, que promet simplificar el procés de purificació AAV i reduir costos. Anem a aprofundir en aquesta investigació dirigida per un equip de la Universitat de Tòquio.

 

1. Antecedents de recerca: reptes i estat actual de la purificació AAV

Els vectors AAV s'han convertit en eines de lliurament "estrella" en teràpia gènica a causa de la seva alta seguretat, baixa immunogenicitat, capacitat d'infectar tant les cèl·lules divisòries i no - i la capacitat per a l'expressió gènica del terme llarg -. Tot i això, el seu procés de producció és complex, particularment els passos de purificació aigües avall, que normalment impliquen múltiples rondes de centrifugació i cromatografia. Aquests mètodes són el temps - que consumeixen, laboral - intensiu, difícil d’escalar i costós.

A escala de laboratori, la purificació sovint es basa en el clorur de cesi o la ultracentrifugació de gradient de densitat de iodixanol, que és difícil escalar per a la producció industrial. La cromatografia d’afinitat s’utilitza cada cop més, però les baixes condicions d’elució que requereix poden deteriorar la infecció viral. Per tant, és fonamental desenvolupar un mètode de purificació AAV simple, eficient, suau i escalable.

La filtració de flux tangencial (TFF) és una mida de separació basada en la mida - que s'utilitza habitualment per concentrar i buffer - bioproductes. No obstant això, el TFF convencional té una capacitat limitada per eliminar les impureses com les proteïnes de cèl·lules hostes (HCPs) i l'ADN durant la purificació AAV, sovint deixant enrere els agregats de proteïnes.

 

2. Aproximació innovadora: TFF combinat amb tensioactius per a la purificació eficient

Per superar les limitacions de la TFF tradicional, els investigadors Rimi Miyaoka, Yuji Tsunekawa i els seus col·legues de la Universitat de Tòquio van idear una estratègia intel·ligent: utilitzar tensioactius per inhibir l’agregació i la interacció de les proteïnes d’impuresa, permetent -los passar per la membrana de partícules de TFF (500 kDA) (~ 25 nm de mida).

Van provar tres tipus de tensioactius:

• No - ionic:Glucòsid d'octil
• Anionic:Desoxicolat de sodi
• Zwitterionic:Xapes

L'estudi va trobar que l'ús d'un tensioactiu iònic no - només era ineficaç. Tant el desoxicolat de sodi anióic com els CHAPs zwitterionics van millorar significativament l’eliminació de les proteïnes residuals i van dirigir diferents poblacions de proteïnes. En última instància, la combinació del 0,5% de desoxicolat de sodi amb 1% de CHAPs va produir resultats notables, eliminant gairebé completament les proteïnes hostes residuals. L’anàlisi de pàgines SDS - només mostrava les tres bandes de proteïnes de càpsida AAV clares (VP1/VP2/VP3).

 

Figura 1. Procés de purificació de TFF sense tensioactius;(a) SDS - Pàgina electroforesi de gel; (b) Microscòpia electrònica de transmissió (TEM)

 

Figura 1. Procés de purificació de TFF amb tensioactius;(a) SDS - Pàgina electroforesi de gel; (b) Microscòpia electrònica de transmissió (TEM)

 

3. Resultats de la investigació: alta puresa, activitat i seguretat

1. Eliminació de la impuresa eficient:El nou mètode va aconseguir eliminació del 99,98% dels HCPs i el 95% de l’eliminació de l’ADN, amb puresa comparable o superior a la de la cromatografia d’afinitat.
2. Infectivitat millorada:Experiments in vitro van demostrar que els vectors AAV1 es purificaven mitjançant aquest mètode infectat per cèl·lules HEK293 de manera més eficient que les purificades per cromatografia d’afinitat (24,9% vs 20,8%), cosa que indica una millor preservació de la bioactivitat viral.
3. Bona seguretat in vivo:Després de la injecció local de vectors AAV1 purificats al múscul esquelètic de ratolí, no es va observar una inflamació significativa ni un dany al teixit després de dues setmanes, demostrant una bona seguretat in vivo.
4. Aplicabilitat de serotip àmplia:El mètode va purificar amb èxit diversos serotips - incloent AAV1, AAV5, AAV8 i AAV9-From Cell Culture Supernatents. No obstant això, per a AAV2, que existeix principalment en els lisats cel·lulars amb càrrega de gran impuresa, cal optimitzar més.

 

4. Resum i Outlook

Aquest estudi va desenvolupar un procés de purificació AAV simple, ràpid (1,5 hores), eficient i escalable. Combinant desoxicolat de sodi i CAPS, es va abordar amb èxit el repte de l’agregació de proteïnes residuals durant la purificació de TFF.

Els avantatges del mètode inclouen:

• Evitar dures condicions de pH baix, preservar millor l’activitat viral
• Reduir els passos de cromatografia, simplificar el flux de treball i estalviar temps i costos
• Fàcilment escalable, adequat per a la producció industrial - a escala
• Proporcionar una nova estratègia per purificar altres biomacromolècules com ara exosomes, altres virus i anticossos recombinants

Les limitacions actuals inclouen la recuperació viral suboptimal i la incapacitat per separar les càpsides buides de les partícules virals completes, cosa que suggereix que el seu millor ús pot ser com a primera captura de pas - en un flux de treball de purificació de pas multi-.

En conclusió, aquesta investigació ofereix una nova opció atractiva per a la producció vectorial AAV aigües avall i té el potencial de reduir significativament el cost dels fàrmacs de teràpia gènica, facilitant la seva aplicació més àmplia.