Precaucions per a l'ús del tub d'ultrafiltració
(1) Seleccioneu el tub d'ultrafiltració adequat. En general, el pes molecular a retenir no ha de ser superior a 1/3 del pes molecular de la proteïna diana. Per exemple, si el pes molecular de la proteïna objectiu és de 35 kDa, es pot seleccionar el tub d'ultrafiltració amb un pes molecular de 10 kDa. Si el pes molecular de la proteïna objectiu és d'uns 10kd, es pot utilitzar un tub d'ultrafiltració amb un pes molecular de 3KD. Llegiu atentament el manual d'instruccions i presteu atenció a la diferent tolerància de la membrana d'ultrafiltració a diversos productes químics.
(2) La ultrafiltració acabada de comprar és seca. Afegiu aigua ultrapura abans d'utilitzar-lo i l'aigua passarà completament a través de la membrana. Refredar-ho prèviament en un bany de gel o a la nevera durant uns minuts. A continuació, aboqueu l'aigua i afegiu la solució de proteïnes. La quantitat afegida no ha de superar la línia blanca a la part superior del tub. L'operació ha de ser lleugera. Abans d'afegir la solució de proteïnes, el tub d'ultrafiltració s'ha d'inserir sobre gel per al prerefrigerament.
(3) Balanç. Tant la massa com el centre de gravetat han d'estar equilibrats. Tingueu en compte que la velocitat i l'acceleració no han de ser massa ràpides, en cas contrari, la membrana d'ultrafiltració es danyarà directament. Inicieu la ultrafiltració centrífuga (prerefrigerament centrífug a 4 graus). Després de convertir les RPM de diferents centrífugues en G, és diferent. Ajusteu l'acceleració de la centrífuga a l'engranatge més baix per reduir la pressió sobre la membrana. Tingueu en compte que heu d'esperar fins que la centrífuga assoleixi la velocitat objectiu abans de sortir de la centrífuga, en cas contrari, quan hi ha un problema amb la centrífuga, no podreu tractar-lo a la primera. La direcció de la membrana i l'eix giratori s'han d'ajustar segons les instruccions (en el cas de la centrífuga giratòria angular, la membrana és perpendicular a l'eix). En l'ús pràctic, la velocitat és generalment inferior a la del manual, cosa que pot allargar la vida útil de la canonada centrífuga.
(4) Quan es concentra a l'1 ml restant, agafeu 50 ul de solució tampó i afegiu-ne 10 ul perquè flueixi per veure si es torna blau, per tal de jutjar si el tub d'ultrafiltració filtra proteïna. Si el tub té fuites, aboqueu la capa superior i flueixi pel nou tub i inicieu la ultrafiltració. Per jutjar amb precisió si el tub té fuites, centrifugueu amb 5 mg de BSA durant 10 minuts i, a continuació, feu fluir, feu córrer la cola de proteïnes o Bradford per a una mesura aproximada i continueu afegint la solució de proteïna restant per a la concentració (operau amb gel per evitar que la proteïna es trobi). escalfat) fins que s'afegeixin totes les solucions concentrades. Preste atenció a si la precipitació de proteïnes es produeix durant la centrifugació, donant lloc a un bloqueig de la canonada. Si es produeix una precipitació, determineu la causa específica de la precipitació, si la concentració de proteïnes és massa alta o si el tampó és inadequat; El primer es pot resoldre mitjançant ultrafiltració simultània amb múltiples tubs d'ultrafiltració per reduir la concentració. Aquest últim és canviar diferents solucions tampó fins que la proteïna no precipiti.
(5) Els passos anteriors s'utilitzen per concentrar proteïnes. Si voleu canviar el tampó, quan la solució de proteïna total es concentra a aproximadament 1 ml, afegiu suaument un tampó nou (ultrafiltració a través de la membrana d'ultrafiltració de 0.22um) i després concentrau-lo a aproximadament 1 ml durant tres vegades consecutives. El volum final de l'última concentració depèn de la concentració de proteïna requerida, que generalment no supera els 500 ul, o es pot concentrar a menys de 200 ul. Segons la concentració de volum d'almenys 10 vegades cada vegada, pot arribar a més de 1000 vegades tres vegades, cosa que bàsicament pot aconseguir el propòsit de canviar el tampó.
