Resum:

Aquest article revisa dos factors clau que s’han de considerar en les estratègies de purificació de proteïnes: requisits d’aplicació aigües avall i les característiques biològiques de les pròpies proteïnes. L’article destaca que la purificació de proteïnes d’alta qualitat és el fonament per a la fiabilitat i la repetibilitat de les dades experimentals, especialment per a la producció de proteïnes recombinants. Diferents escenaris d’aplicació tenen requisits específics per a la puresa de proteïnes, l’activitat o el contingut d’endotoxina i les característiques de les proteïnes poden afectar significativament les estratègies de purificació. Segons casos específics, l’article il·lustra que les proteïnes úniques haurien d’adoptar esquemes de purificació personalitzats. Finalment, es va proposar un procés sistemàtic de producció de proteïnes (figura 1), destacant el control de qualitat del procés complet de la selecció de sistemes d’expressió, disseny de construcció a l’optimització de purificació i recomanant l’avaluació de l’homogeneïtat i la funcionalitat de proteïnes mitjançant tècniques biofísiques (com ara SEC-Mals, DSF, etc.). Aquest article pretén proporcionar orientació pràctica als investigadors, ajudant -los a formular estratègies de purificació eficients i repetibles basades en les característiques i els requisits d’aplicació de les proteïnes objectiu, millorant així la qualitat i l’eficiència de la investigació científica.

 

Figura 1. Diagrama esquemàtic del procés de producció de proteïnes

 

Producció de proteïnes d’alta demanda: exemples d’identificació de problemes, disseny d’estratègia de mitigació i sortida corresponent

 

1. Unió de l’àcid nucleic a la proteïna:

Quan es purifica les proteïnes d’unió a l’àcid nucleic, es necessiten diversos passos per eliminar la contaminació per l’àcid nucleic. Durant la lisi, cal afegir nucleases (com la nucleasa SM (benzonasa®) o DNase o RNasa), però els àcids nucleics units no es poden eliminar completament. Substituïu els passos d’eliminació d’àcids nucleics, com la PEI o la precipitació de sulfat de estreptomicina, la purificació de l’heparina o la cromatografia d’intercanvi d’ions. La presència d’àcids nucleics es va controlar mitjançant la relació de A26 0 nm/a28 0 nm durant tot el procés de purificació. Si la proporció era inferior a 0,6, indicava que la puresa de proteïnes era relativament alta i la contaminació per l’àcid nucleic era mínima. Per a les proteïnes amb àcids nucleics fortament lligats, es poden desnaturalitzar temporalment (com ara tractats amb urea) i després renaturat. Punts clau: utilitzeu reactius d’alta qualitat, buffers frescos i columnes netes (netegeu amb NaOH de 0,5 m abans d’utilitzar).

 

2. Cadena pesada de ferritina del ratolí:

L’objectiu de produir proteïna de cadena pesada de ferritina de ratolí purificada (MFTH1) és una microscòpia criodelectrònica d’alta resolució (CRYO-EM). El vector d’expressió d’Escherichia coli codificat sense etiqueta MFTH1 es va alterar ultrasònicament sense afegir cap nucleasa. Després d'escalfar -se a 7 0 grau, es va sotmetre a les precipitacions de sulfat d'amoni, diàlisi i exclusió de la mida de la cromatografia. La mostra resultant va mostrar la presència d’una gran quantitat de contaminants en imatges de microscòpia crio-electrònica (figura 2A), que no va ser totalment apta per a la seva aplicació. Optimitzeu els passos. Afegiu la nucleasa SM durant el procés de lisi cel·lular i el procés de diàlisi després de la precipitació del sulfat d'amoni i, a continuació, afegiu el pas de cromatografia d'intercanvi d'anions per reduir la relació de A26 0 nm/A280Nm de 1,4 a 0,8. Després de la cromatografia d’exclusió de mida, la relació de A260Nm/A280Nm de la mostra MFTH1 final va ser de 0,56. Les imatges de microscòpia SDS-PAGE i crio-electrònica (figura 2B) van demostrar que la proteïna era molt pura, cosa que indica que els contaminants s’havien eliminat efectivament.

Figura 2 Cadena pesada de ferritina del ratolí

 

 

 

3. Proteïna quimèrica DSRBEC humana (DSRBD-EGF-quimera):

El DSRBEC està format per la fusió del domini d’unió d’ARN de doble cadena (DSRBD) del proteïna cinasa R i el factor de creixement epidèrmic humà (HEGF). Quan el DSRBD s’expressa a Escherichia coli, mostra una capacitat d’unió DSRNA extremadament alta. Després de la lisi cel·lular, l’ARN contaminant dificultarà la unió de proteïnes recombinants a la columna fixa de la cromatografia d’ions d’ions metàl·liques (IMAC). Els mètodes convencionals com la PEI o la precipitació del sulfat de la streptomicina, el tractament amb RNase o les solucions tampons de gran sal no poden eliminar l'ARN. La lisi cel·lular es va realitzar mitjançant un buffer que conté la urea de 4 m. El sobrenadant es va carregar en una columna IMAC i es va utilitzar lentament la urea de 4M a 0 m (Renaturació de la columna). El buffer de renaturació es va afegir amb imidazol i es va eluir de la columna IMAC. El perfeccionament final es va dur a terme mitjançant la filtració de gel de Superdex 75 per obtenir DSRBEC funcionalment actiu.

 

4. Proteïnes lligades a cations divalents o altres cofactors:

Per a proteïnes que interaccionen amb cations divalents com Zn 2+, Fe 2+, Cu 2+, o altres cofactors, és crucial afegir cations divalents específics (o altres cofactors) durant l'expressió. També es requereix una petita quantitat dels mateixos cations divalents (o altres cofactors) durant el procés de purificació. Tanmateix, cal evitar l’ús d’agents quelants (com EDTA, EGTA) i agents reductors que queden (com DTT o DTE). Quan es tracten de proteïnes unides a cations divalents, cal utilitzar una barreja d’inhibidors de proteasa sense agents quelants per confirmar la presència real de cations divalents (o altres cofactors) en la proteïna purificada mitjançant mètodes espectroscòpics (com l’espectrofotometria d’absorció atòmica).

 

5. Ferridoxina recombinant (RFD) que conté un clúster únic [2fe ± 2s] de cianobacteris termòfils mastigocladus laminosus laminosus

La ferridoxina és una proteïna soluble de sofre de ferro que participa en les reaccions de transferència d’electrons. La ferroredoxina de tipus vegetal porta un clúster [2Fe ± 2S] com a acceptor d’electrons del fotosistema I. La soca Escherichia coli BL21 (DE3) va expressar la proteïna RFD recombinant en el medi TB que contenia 10mm FECL3 i antibiòtics. L’elució de la columna de captura IMAC es va realitzar mitjançant un tampó que contenia histidina de 10 mm per evitar imidazol i evitar la destrucció del clúster [2fe ± 2s]. La cromatografia d'exclusió d'anions i exclusió de mida es va utilitzar per a la purificació i la concentració de 12mg/ml per al cribratge de cristal·lització. En comparació amb la producció recombinant de ferroredoxina, la ferroredoxina natural purificada de les algues blaves de color verd blau mastigocladus laminosus va aconseguir una resolució més elevada durant la cristal·lització.

 

6. Proteïnes utilitzades com a antígens

Les proteïnes s’utilitzen sovint com a antígens per recuperar lligands específics de l’objectiu. El primer que cal tenir en compte és si la proteïna s’utilitza per a la immunitat in vivo per obtenir IgG monoclonal o policlonal convencional o per a programes que impliquen IgG de camells o processos de selecció in vitro.

 

6.1 Els antígens utilitzats per a la producció rutinària d’anticossos

Quan els antígens s’utilitzen per produir anticossos IgG monoclonals, el plegament correcte de l’antigen no sol ser necessari, perquè la majoria d’anticossos monoclonals reconeixen els epítops lineals que no estan afectats molt a l’estructura de l’antigen, i fins i tot els antígens desnaturats (com les proteïnes del cos d’inclusió) continuen sent efectius. Tanmateix, la puresa ha de ser estrictament controlada per evitar forts contaminants immunogènics que interfereixen amb la resposta immune i provocant el domini d’anticossos no objectius.

 

6.2 Cribratge de la biblioteca conjugada

S’ha de prestar una atenció especial al manteniment de la conformació natural de l’antigen durant el processament de la biblioteca de nanobodies obtinguda per la immunització del camell. A diferència dels anticossos convencionals, els anticossos de Camel (sobretot els nanobodies) solen reconèixer els epítops estructurals, que estan relacionats amb la seva estructura única de lloc convex. De la mateixa manera, quan es projecta grans biblioteques d’anticossos sintètics o naturals in vitro, l’antigen ha de mantenir una estructura completament coherent amb l’aplicació objectiu. Com que el procés de cribratge no està esbiaixat, si l’antigen té una desplegament, l’agregació o l’heterogeneïtat conformacional, es poden seleccionar un gran nombre de conjugats dirigits a epítops no naturals.

 

 

 

7. Proteïnes que contenen enllaços disulfur intermoleculars o intramoleculars o cisteïna lliure

Els enllaços disulfur són crucials per estabilitzar l'estructura natural de les proteïnes. Durant el procés de purificació, quan la purificació de proteïnes que contenen enllaços disulfur intermoleculars o intramoleculars, cal evitar afegir agents reductors per evitar canvis conformacionals de les proteïnes, alterant així les seves funcions. Per a les proteïnes que contenen cisteïna lliure, els agents reductors són indispensables en tots els passos del procés de purificació, especialment durant l’emmagatzematge, per evitar la formació d’enllaços de disulfur artificial. Els agents reductors més utilitzats són el ditiotreitol (DTT), -Mercaptoetanol (-me) i Tris ({{2} carboxietil) de clorhidrat de fosfina (TCEP). Per a les resines IMAC incompatibles amb DTT o TCEP, es recomana utilitzar -ME i substituir -les per altres agents reductors en passos posteriors.

 

8. Fragment d’anticossos recombinant

Tot i que l'estructura dels fragments d'anticossos recombinants (com els nanobodies) és més senzilla que la d'IgG, la seva funció depèn de la formació correcta d'enllaços disulfur. En els sistemes d’expressió bacteriana, fins i tot amb l’adopció d’estratègies d’optimització, encara es poden produir productes malplegats o parcialment plegats, que existeixen tant a la part soluble com al cos d’inclusió. Més ocultat és que fins i tot els fragments d’anticossos plegats correctament poden formar agregats solubles (agregació col·loide) a través de plaques hidrofòbiques a la superfície. Aquests agregats són difícils d’identificar en proves funcionals rutinàries (com ELISA) perquè la unió multivalent pot emmascarar la disminució de l’afinitat del monòmer, però la seva presència pot afectar greument les aplicacions que es basen en la mida de les molècules petites (com la microscòpia de super resolució). Per tant, confiar exclusivament en SDS-PAGE és insuficient per avaluar la qualitat de la mostra. S'han d'adoptar mètodes biofísics com la filtració de gel (figura 3) per distingir els monòmers (pics principals) dels agregats (pics de volum d'exclusió). Els punts de control clau inclouen: optimitzar l’entorn redox durant l’expressió per promoure la formació d’enllaços disulfur i optimitzar les condicions d’emmagatzematge després de la purificació per evitar l’agregació. Aquestes mesures són crucials per assegurar la monodispersperitat i la funció dels fragments d’anticossos.

Figura 3. Separació de filtració de gel dels agregats solubles de nanobodies

 

9. Fragments solubles del receptor de limfòcits LLT1

L’expressió recombinant de proteïnes dependents de l’enllaç disulfur (com el receptor de limfòcits LLT1) sovint s’enfronta a dificultats de plegament. La filtració en gel de LLT1 de tipus salvatge va mostrar els pics d’agregació i els pics del dimer (figura 4a), però l’espectrometria de masses va revelar un desplegament causat per cisteïna no aparellada al dímer (figura 4B). Per a aquest propòsit, es van dissenyar dos mutants: un va eliminar el problema de la cisteïna, donant lloc a una caiguda sobtada del rendiment (figura 4A); Després de la introducció de la neocisteïna per reconstruir l’enllaç disulfur conformat, el mutant no només tenia un rendiment elevat i una bona estabilitat, sinó que també es podia cristal·litzar (figura 4C), i l’estructura 3D va confirmar que el mutant formava l’enllaç disulfur correcte i mantenia el plegament natural. Aquest cas demostra que mitjançant el disseny racionalment d’enllaços disulfur conformals, combinats amb la filtració de gel i l’anàlisi d’espectrometria de masses, es poden resoldre eficaçment el problema plegable de les proteïnes recombinants i es poden obtenir proteïnes funcionals amb estructures estables i rendiments elevats.

Figura. Figura. La reconstrucció de l'enllaç disulfur millora el plegament i el rendiment de LLT1 soluble

 

 

 

10. Proteïnes fàcilment agregables

La purificació de proteïnes recombinants sovint s’enfronta al problema de l’agregació i la seva formació segueix el mecanisme de “creixement de nucleació”: una petita quantitat d’agregats solubles es formen primer i després desencadena l’agregació insoluble a gran escala. Per afrontar aquest repte, cal adoptar estratègies a diversos nivells: a l’etapa d’expressió, es pot aconseguir optimitzant la soca, reduint la temperatura del cultiu, utilitzant medis de cultiu modificats o diferents proteïnes de fusió solubilitzant i substituint els sistemes d’expressió (insectes/cèl·lules de mamífers), etc. Durant l’etapa de purificació, es requereix un funcionament ràpid (en un entorn C de 4 graus) per evitar una concentració de proteïna excessiva i una "estratègia de purificació ràpida" (la connexió directa per fer una connexió directa per a una connexió ràpida (una connexió directa per a una connexió directa per fer una connexió ràpida (una connexió directa. Imac a sec) s’ha d’adoptar per eliminar ràpidament els nuclis agregats. En general, quan es poden tenir en compte les solucions de tampó de cribratge, s’han de tenir en compte factors com la composició de components, el valor de pH, l’agent dissociant o el solubilitzador (figura 5). Mitjançant l’optimització fina de la detecció ortogonal (com ara SEC, CD, LS, DSF i canvi de temperatura basat en la calor de fluorescència, etc.), es va determinar la qualitat de proteïna i la solució tampó més adequada.

Figura 5. Estratègies per alleujar l’agregació de proteïnes

 

11. Cristal·lització de la cinasa CLK1 humana (com obtenir lots reproduïbles)

Per obtenir homogènia no fosforilada CLK1 kinasa per a estudis de cristal·lització, es va adoptar un esquema de col·laboració de diverses estratègies. En primer lloc, es va co -expressar amb la λ -fosfatasa a Escherichia coli per eliminar l'heterogeneïtat de l'autofosforilació. Tot i que es va reduir el rendiment, es va assegurar la desfosforilació completa. Després de la captura per IMAC, l’eluent es va complementar amb estabilitzadors (50mm arginina, àcid glutàmic de 50 mm i 10mm DTT) per evitar l’agregació, concentrada i la seva etiqueta es va eliminar per la digestió de TEV. A continuació, l’oligòmer correcte es va separar per SEC (que conté un 5% de glicerol i -ME). El pas d’intercanvi d’anions crucial final distingeix entre els grups Clk1 cristal·lins (no fosforilats) i no cristalins (parcialment fosforilats). Val la pena destacar que el mode de lisi cel·lular afecta significativament l’estabilitat de les proteïnes: el mètode d’alta pressió i d’alta temperatura condueix a l’agregació irreversible de CLK1, destacant la importància del tractament lleu per a la preparació de la cinasa.

 

 

 

12. Produeix la galectina -1 amb capacitat de lligat de lligands estable

Per preparar la galectina funcional -1 per a estudis d’unió de lligands, es van comparar les estratègies d’expressió i purificació de quatre construccions (sense etiqueta i sense his de la galectina salvatge -1, sense etiquetar i amb la cisteïna sense cisteïna -1). Els resultats clau indiquen que la purificació de la cromatografia d’afinitat de la lactosa pot analitzar eficaçment les proteïnes plegades correctament, però s’ha de combinar amb diàlisi exhaustiva (tampó HEPES) per eliminar completament la lactosa del lloc d’unió i restaurar l’activitat CRD. La galectina de tipus salvatge -1 és propensa a l’oxidació i la inactivació, i la seva estabilitat es manté limitada fins i tot en presència d’agents reductors (figura 6). No obstant això, el mutant lliure de cisteïna millora significativament l'estabilitat a llarg termini mantenint l'activitat d'aglutinació comparable i l'estabilitat tèrmica (verificada per Nanodsf, ITC, etc.) eliminant la dependència de l'enllaç disulfur.

Figura 6. La caracterització hidrodinàmica de la galectina recombinant -1 revela la seva inestabilitat

 

13. Eliminació de l'endotoxina

El mètode d’eliminació d’endotoxina es basa en una cromatografia d’afinitat que inclou cromatografia carregada positivament (intercanvi d’anions), l’ús de lligands policacionistes (com la poli-L-lisina (PLL), la poliamina immobilitzada (polimixina B)) i l’addició del tritó de superfície x -114. Durant el procés de purificació, presteu atenció a la preparació de la solució tampó amb aigua lliure de LPS i utilitzeu noves columnes o columnes que només s’han utilitzat en altres purificacions sense LPS. Per a la contaminació en endotoxina, el sistema cromatogràfic de bomba/fluid es pot incubar durant la nit a 0. La quantitat final de LPS a la mostra es va avaluar mitjançant un reactiu de lisat de Limulus amebòcits (LAL), i es va comprovar si estava per sota del límit necessari per a l’aplicació específica.

 

14. Complex de proteïnes

L’expressió i la purificació dels complexos de proteïnes han d’optimitzar -se segons condicions específiques. Els reptes inclouen la inestabilitat o el desplegament de subunitats. Cada subunitat es pot expressar de manera independent i muntar in vitro o co-expressar-se per formar complexos de proteïnes funcionals. El disseny de la construcció s’ha d’introduir detingudament amb etiquetes de purificació o detecció per evitar interferir en el muntatge, sobretot quan la informació complexa és limitada i es requereixen múltiples optimitzacions. Durant el procés de purificació, cal avaluar la integritat i l'estabilitat del complex. Els mètodes inclouen SDS-PAGE (detecció de subunitats), SEC (homogeneïtat), SEC-mals (anàlisi de massa molar), fotometria de massa o espectrometria de masses natural (verificació de massa). Cal destacar que el complex pot dissociar -se a baixes concentracions. En aquest moment, cal optimitzar el mètode o tampó cromatogràfic (com per exemple mitjançant la deriva tèrmica o el cribratge de DSF). A més, reduir els passos de purificació pot evitar la pèrdua de subunitats d’interacció febles i equilibrar l’eficiència de purificació i la integritat del complex.

 

 

 

15. Purificació de complexos antigen-anticossos

Els complexos d’anticossos-antigen són exemples típics de complexos proteics. La seva co-cristal·lització pot revelar patrons d’unió i guiar l’optimització de l’enginyeria d’anticossos. Els mètodes tradicionals requereixen una purificació separada d’antígens i anticossos i després barrejar -los. Tot i això, estudis recents han demostrat que les estratègies de co-expressió i co-purificació són més eficients. Només es necessita una única purificació per obtenir el complex i, alhora, es poden estabilitzar antígens inestables a través d’anticossos i fins i tot es pot aconseguir una expressió lliure d’etiquetes. En aquesta situació específica, la filtració SDS-PAGE i Gel (SEC) sol ser suficient per avaluar la puresa i la qualitat del complex.

 

Sumari

La purificació de proteïnes és una tecnologia fonamental en la investigació científica. La producció de proteïnes a escala acadèmica sol seguir estratègies estàndard i pot produir proteïnes solubles a nivell de mil·ligram d’alta puresa, que s’utilitzen àmpliament en la biologia estructural, la bioquímica i la investigació funcional. No obstant això, els requisits especials de les aplicacions aigües avall (com la necessitat de no endotoxina en experiments amb animals i sense contaminació de nucleasa en investigació en àcid nucleic) o les característiques inherents de les proteïnes (com ara una agregació fàcil, que contenen enllaços de disulfur o alta afinitat d’àcid nucleic) sovint requereixen solucions personalitzades. Aquesta revisió, en resposta a aquestes circumstàncies especials, proposa estratègies refinades que van des de la selecció de sistemes d’expressió, el disseny de construccions (optimització d’etiquetes i límits de domini) fins al procés de purificació i introdueix el control de qualitat (com SEC, SDS-PAGE, detecció d’activitats, etc.) en passos clau. Algunes aplicacions també requereixen anàlisis addicionals (com la detecció de l’endotoxina i la determinació de residus d’àcids nucleics), similar al concepte de “garantia de qualitat” (QA) de la indústria biofarmacèutica, és a dir, per evitar defectes mitjançant processos sistemàtics. En formular directrius de control de qualitat i aclarir estàndards específics per als reactius proteics utilitzats en la investigació científica, l’objectiu és establir normes de purificació de proteïnes més rigoroses per a laboratoris acadèmics, millorar la fiabilitat i la repetibilitat de les dades experimentals i solucionar la bretxa entre la investigació bàsica i els estàndards industrials.

 

Doi: 10.1186/s 12934-022-01778-5