Com triar el tub d'ultrafiltració adequat
Els tubs d'ultrafiltració utilitzats comunament per a la concentració de proteïnes i la substitució de tampó s'utilitzen sovint en tubs d'ultrafiltració. Hi ha altres models, que tenen diferents mides de volum i tubs d'ultrafiltració, depenent del pes molecular de la proteïna diana, el volum abans de la concentració i el volum objectiu de concentració. Reutilitzable.
1. Seleccioneu un tub d'ultrafiltració adequat, principalment tenint en compte MWCO i el volum de concentració. En general, el pes molecular no ha de ser superior a 1 / 3 del pes molecular de la proteïna diana. Si el pes molecular de la proteïna diana és d'uns 10 kd, es pot utilitzar un tub d'ultrafiltració amb un pes molecular retingut de 3 KD.
2. La ultrafiltració recentment adquirida està seca. Afegiu-hi aigua mil·liq abans d'utilitzar-la. L'aigua passa completament a través de la membrana i es prereia en un bany de gel o nevera durant uns minuts. A continuació, aboqueu l'aigua per afegir la solució proteica. La quantitat de solució proteica no ha d'excedir la línia blanca a la part superior del tub d'assaig. Fàcil operació. Abans d'afegir la solució proteica, el tub d'ultrafiltració s'ha d'inserir al gel per prefredar-lo.
3. Equilibri. La massa i el centre de gravetat han d'estar equilibrats. Tingueu en compte que la velocitat i l'acceleració no han de ser massa ràpides, en cas contrari, la membrana d'ultrafiltració es farà malbé directament. Inici de la ultrafiltració centrífuga (precooling la centrifugadora a 4 graus). La direcció del diafragma i l'eix giratori es pot ajustar d'acord amb les instruccions (en el cas de la centrifugadora d'angle, el diafragma és perpendicular a l'eix). En l'ús real, la velocitat general és inferior a l'especificada en el manual, la qual cosa pot allargar la vida útil de la canonada centrífuga.
4. quan es concentra a l'1 ml restant, [prendre la solució de Bradford domèstica 50ul, afegir líquid 10ul per veure si es torna blau, i determinar si el tub d'ultrafiltració fuita la proteïna. Si el tub es filtra, aboqueu-lo a la capa superior i després torneu al nou tub per iniciar la ultrafiltració. Per determinar amb precisió si el tub d'assaig es filtra, si us plau 5mg 10min centrifuga 10min, a continuació, passar-lo a través, executar el gel de proteïnes o Bradford] [mesura gruixuda]. Continueu afegint la solució proteica restant per concentrar-vos (operar sobre gel per evitar l'escalfament de proteïnes) fins que s'afegeixin totes les solucions concentrades. Durant la centrifugació, prestar atenció a si la precipitació de proteïnes es produeix i causa bloqueig del tub. Si es produeix precipitació, si us plau, determineu la causa específica de la precipitació, si la concentració de proteïnes és massa alta o si el tampó és inadequat; El primer es pot resoldre mitjançant l'ús de múltiples tubs d'ultrafiltració al mateix temps per reduir la concentració, mentre que el segon pot canviar diferents amortidors fins que la proteïna precipita.
5. Els passos anteriors s'utilitzen per concentrar proteïnes. Si el tampó s'ha de substituir, quan la solució proteica total es concentra a aproximadament 1 ml, afegiu suaument un nou tampó (ultrafiltració a través de la membrana d'ultrafiltració 0,22um), i després concentreu-vos contínuament a aproximadament 1 ml durant tres vegades, de manera que la concentració final depèn de la concentració de proteïnes requerida, que normalment no és superior a 500ul o menys de 200ul. Segons la concentració de volum d'almenys 10 vegades cada vegada, és més de 1000 vegades la de tres vegades, el que bàsicament pot aconseguir el propòsit de canviar la memòria intermèdia.
6. Eliminar el concentrat final de proteïnes. Operar sobre gel. Utilitzant una punta de pipeta groga (200ul), inseriu suaument la punta de pipeta al llarg de la vora, a continuació, bufeu suaument i barregeu la solució de proteïnes. Aneu amb compte de no tocar la membrana d'ultrafiltració. Xuclar la solució concentrada a 200ul cada vegada fins que es xucla completament. No cal extreure l'última solució concentrada a la part inferior del tub d'assaig, en cas contrari és massa difícil i la membrana d'ultrafiltració pot estar danyada. Finalment, s'afegeix aigua mil·liq al tub d'ultrafiltració sense passar per la membrana d'ultrafiltració per evitar la pèrdua d'aigua i l'assecat de la membrana.
7. A continuació es presenten els passos per tractar el tub d'ultrafiltració i reutilitzar el tub d'ultrafiltració.
8. Abocar aigua al tub d'ultrafiltració i esbandir suaument amb aigua mil·liq durant diverses vegades. [Si hi ha precipitació proteica òbvia a la part inferior del tub d'assaig, primer podeu afegir aigua i després bufar-la amb una pipeta. Aneu amb compte de no tocar la membrana. El sediment cau i després s'escapa. No es pot rentar amb aigua de l'aixeta. Després d'afegir 0,2 m de solució NaOH, col·loqueu-lo a temperatura ambient durant 20 minuts i equilibrar el tub d'ultrafiltració durant aquest període. Centrífuga durant 10 minuts més. Abocar la solució NaOH restant i submergir el nucli de cotó en el vas (1 o 2L) aigua Miliq, col·locat durant diverses hores, i després reemplaçat per aigua nova, col·locat durant diverses hores per diluir contínuament la concentració de NaOH. Rentar el tub d'assaig de 50 ml i cobrir amb aigua de l'aixeta, i rentar la paret interior amb aigua mil·liq.
9. Traieu el nucli del tub d'assaig submergit, afegiu-lo a l'aigua mil·liq completa i, a continuació, ompliu el tub d'assaig de 50 ml amb aigua mil·liq. Col·loqueu lentament el nucli del tub en 50 ml.
Centrífuga tub, drenar i dividir l'aigua, a continuació, cobrir i emmagatzemar a 4 graus fins al següent ús. En termes generals, d'acord amb els passos i precaucions anteriors, cada tub no es trencarà en tres o quatre anys.