Principis bàsics i flux de treball de la síntesi de-pèptids en fase sòlida (SPPS)
Síntesi de pèptids en fase{{0}sòlida (SPPS)és un mètode per sintetitzar pèptids sobre un suport sòlid. Les principals estratègies SPPS inclouenMètode Boci elMètode Fmoc. La síntesi de pèptids és un procés repetitiu d'addició seqüencial d'aminoàcids i es realitza generalment a partir deC-terminal (extrem carboxil)alN-terminal (extrem amino). En primer lloc, el grup carboxil del primer aminoàcid del pèptid objectiu s'uneix de manera covalent a un suport sòlid (resina). Utilitzant el grup amino d'aquest aminoàcid com a punt de partida, s'elimina el grup protector N-terminal i la cadena peptídica en creixement s'allarga per reacció amb un excés d'un segon aminoàcid activat. Aquest cicle-acoblament → rentat → desprotecció → neutralització i rentat → següent acoblament-es repeteix fins que s'aconsegueix la longitud de pèptid desitjada. Finalment, la cadena peptídica es separa de la resina i es purifica per obtenir el pèptid objectiu. Quan el grup -amino està protegit ambBoc (tert-butiloxicarbonil), el mètode s'anomenaSíntesi de pèptids en fase sòlida-boc-basada en Boc. Quan el grup -amino està protegit ambFmoc (9-fluorenilmetiloxicarbonil), es coneix comSíntesi de pèptids en fase sòlida-basada en Fmoc-.
Síntesi de pèptids en fase sòlida-basada en Boc-(mètode Boc)
En elMètode Boc, Grups Boc eliminables per àcid trifluoroacètic (TFA)s'utilitzen per protegir els -grups amino, mentre quegrups protectors de tipus-benzils'utilitzen per a cadenes laterals. Durant la síntesi, un aminoàcid -protegit amb Boc-s'uneix primer de manera covalent a la resina. A continuació, s'elimina el grup Boc amb TFA i l'extrem amino final lliure resultant es neutralitza amb trietilamina. El següent aminoàcid s'activa ambDCC (diciclohexilcarbodiimida)i acoblat per estendre la cadena peptídica. Un cop finalitzat el muntatge, el pèptid objectiu es separa de la resina mitjançant un àcid fort, normalmentfluorur d'hidrogen anhidre (HF)oàcid trifluorometanosulfònic (TFMSA).En el mètode de síntesi Boc, es requereixen tractaments àcids repetits per eliminar grups protectors abans de cada pas d'acoblament. Això pot provocar diverses reaccions secundaries, com ara la divisió prematura del pèptid de la resina i la inestabilitat de les cadenes laterals d'aminoàcids en condicions àcides, donant lloc a reaccions secundaries no desitjades.
Síntesi de pèptids en fase sòlida-basada en Fmoc-(mètode Fmoc)
En1978, Meienhofer i Athertonva desenvolupar una estratègia de síntesi de pèptids utilitzantFmoc (9-fluorenilmetiloxicarbonil)com el -grup protector d'amino, conegut com aMètode Fmoc. En aquest enfocament, el grup -amino està protegit ambbase-labile Fmoc, mentre que les cadenes laterals estan protegides ambgrups protectors de tipus àcid-làbils Boc-.Un avantatge important de Fmoc com a grup-protector d'aminos és el seuestabilitat en condicions àcides; no es veu afectada pel tractament amb reactius com araàcid trifluoroacètic (TFA)i es pot eliminar selectivament mitjançantbase suau. Al mateix temps, els grups protectors de la cadena lateral-com ara Boc són estables en condicions bàsiques i s'eliminen amb tractament àcid. Finalment, el pèptid es separa quantitativament de la resina mitjançantTFA/diclorometà (DCM), evitant l'ús d'àcids forts i millorant així la seguretat i la compatibilitat amb la síntesi rutinària de pèptids.
Historial de desenvolupament de la síntesi de-pèptids en fase sòlida (SPPS)
1. Etapa fundacional (inicis del segle XX fins a 1963)
En1902, Emil Fischerva ser el primer a explorar la síntesi de pèptids, però el progrés va ser lent a causa de les limitacions tècniques. Les primeres síntesis utilitzadesgrups protectors benzoil i acetil, que eren difícils d'eliminar i sovint conduïenruptura de la cadena peptídica.
En1932, Max Bergmanni companys{0}}de treball van presentar elgrup benciloxicarbonil (Z).com a -grup protector d'amino. Aquest grup es podria eliminar a sotahidrogenació catalítica o condicions àcides, proporcionant una eina més fiable per a la síntesi de pèptids i establint les bases per al desenvolupament de la síntesi de pèptids-sòlids als anys 60.
Durant el1950s, els científics van sintetitzar amb èxit una varietat depèptids biològicament actius, com araoxitocina i insulina. Aquests èxits van avançar encara més la química dels pèptids i van establir les bases per a l'aparició de la síntesi de pèptids en fase sòlida-.
2. Etapa pionera (1963)
En1963, Robert B. Merrifieldva proposar elmètode de síntesi de pèptids en fase{{0}sòlida (SPPS)., en què elAminoàcid C-terminalestà ancorat a un suport de resina i la cadena peptídica s'allarga a través de cicles repetits dedesprotecció i acoblament. Aquest enfocament va simplificar molt el procés de síntesi de pèptids i es va convertir en elmètode preferitper a l'assemblatge de pèptids.
Merrifield utilitzatBoc (tert-butiloxicarbonil)per protegir el grup -amino. A finals de la dècada de 1960, també va desenvolupar elprimer sintetitzador de pèptids totalment automatitzati sintetitzat amb èxitproteïnes biològiquescom araribonucleasa (124 aminoàcids). Per aquests èxits innovadors, Merrifield va rebre el premiPremi Nobel de Química l'any 1984.
3. Etapa d'innovació tecnològica (1972)
En1972, Lou Carpinodesenvolupat elGrup protector 9-fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc)., que pot sers'elimina suaument en condicions bàsiques, reduint les reaccions secundaries. Això el va fer especialment adequat per apèptids complexosisíntesi automatitzada.
ElMètode Fmocva substituir gradualment el mètode Boc com a estratègia principal. Sintetitzadors de pèptids automatitzats basats en tots dosQuímica Fmoc i Boces van desenvolupar posteriorment, impulsant elautomatització de la síntesi de pèptidsi millorant molt l'eficiència i la reproductibilitat.
4. Etapa de maduresa i expansió (de la dècada de 1990 fins a l'actualitat)
Optimització de resines i reactius:Desenvolupament deResines modificades amb PEG-hidrofíliques-alta càrregai reactius d'acoblament eficients com araHBTUiHATUha millorat significativament l'eficiència i el rendiment de la síntesi de pèptids en fase sòlida-(SPPS).
Integració tecnològica:Nous enfocaments comsíntesi assistida{0}}per microonesiquímica de fluxhan reduït els temps de reacció i han augmentat encara més els rendiments.
Principis bàsics i flux de treball de SPPS:
El principi bàsic de la síntesi de pèptids-sòlids és elconstrucció gradual d'una cadena peptídica sobre un suport sòlid, utilitzantestratègies de protecció del grupireaccions de condensació (acoblament).per aconseguirmuntatge de pèptids eficient i controlable.
1. Paper del suport sòlid (resina) en la síntesi de pèptids en fase sòlida (SPPS)
A resina polimèrica insoluble-com araresina de poliestirè-divinilbenzè-encreuat, resina Wang o resina d'amida Rink-està seleccionat com a suport sòlid a SPPS. La superfície de resina contégrups funcionals(per exemple, grups hidroxil o amino) que es poden formarenllaços covalents amb un extrem de la cadena peptídica, normalment elC-terminal, ancorant el pèptid al suport sòlid. Aquesta unió covalent garanteix que el pèptid en creixementroman lligat a la resina durant tota la síntesi, que moltfacilita els passos de reacció posteriors, el rentat i la purificació
2.Protecció de l'estratègia de grup en la síntesi de pèptids en fase sòlida (SPPS)
Durant la síntesi de pèptids, el-grup amino, grup carboxil i grups funcionals de cadena lateral reactiva-d'aminoàcids (com ara tiol, carboxil i grups amino) són propensosreaccions secundaries. Per evitar aquestes reaccions no desitjades,grups protectorss'utilitzen. Els grups protectors comuns inclouen:-Grups protectors d'amino:
Boc (tert-butiloxicarbonil):Àcid-làbil, s'elimina fàcilment per sotacondicions àcides.
Fmoc (9-fluorenilmetiloxicarbonil):Estable en condicions àcides, es pot eliminar sotacondicions bàsiques(per exemple, solució de piperidina/DMF).Grups de protecció de-cadenes laterals:Seleccionat segons les propietats químiques de la cadena lateral d'aminoàcids.Els grups comuns inclouenbenzil (Bn), tert-butil (tBu), tritil (Trt), etc.Aquests grups sóneliminat al final de la síntesi, generalment durant la divisió del pèptid de la resina, utilitzantàcid o altres condicions específiques.
3.C-Síntesi de terminal a N-terminal a SPPS
Ensíntesi de pèptids-sòlids (SPPS), el muntatge de pèptids sol començar a laC-terminal (extrem carboxil)i avança gradualment cap a laN-terminal (extrem amino). Això és perquè elL'aminoàcid C-terminal s'uneix primer al suport sòlid, i els aminoàcids posteriors s'acoblen algrup amino lliure de la cadena peptídica ja unida a la resina, allargant gradualment la cadena peptídica.
4.Reacció d'acoblament en la síntesi de pèptids en fase-sòlida (SPPS)
Els aminoàcids protegits han de seractivatde manera que els seusels grups carboxil es tornen reactius, que els permet formar aenllaç peptídicamb el grup amino del pèptid-unit a la resina. Comúreactius activadorsinclourecarbodiimides(p. ex., DCC, DIC),HOBt, HATU, iPyBOP. Un cop activat, el grup carboxil reacciona amb el grup amino lliure en areacció de condensació, formant unenllaç amidai així unir el nou aminoàcid a la cadena peptídica en creixement.
5. Operacions repetitives (cícliques) en la síntesi de pèptids en fase sòlida- (SPPS)
El procés implicarepetint el cicle de desprotecció → acoblament → rentat, afegintun aminoàcid per cicleper allargar gradualment la cadena peptídica. Després de cadareacció d'acoblament, la resina ésrentat(p. ex., amb dissolvents com el DMF o el DCM) per eliminar reactius no reaccionats, subproductes i l'excés d'aminoàcids. El-El grup amino del residu recent afegit es desprotegeix aleshores, exposant una amina lliure per preparar-se per a la següent reacció d'acoblament. Aquest cicle es repeteix fins que la seqüència de pèptids desitjada està completament acoblada.
6.Cissió en síntesi de pèptids en fase-sòlida (SPPS)
Un cop la cadena peptídica ha arribat a la longitud desitjada, ho ésescindida del suport sòlidutilitzant un reactiu adequat, alhoraeliminant tots els grups protectors. Un reactiu d'escissió d'ús habitual ésàcid trifluoroacètic (TFA), que no noméstrenca l'enllaç entre el pèptid i la resinaperò tambéelimina els grups protectorscom Fmoc i Boc, restaurant el pèptid al seuestat nadiu. Un cop la cadena peptídica ha arribat a la longitud desitjada, ho ésescindida del suport sòlidutilitzant un reactiu adequat, alhoraeliminant tots els grups protectors. Un reactiu d'escissió d'ús habitual ésàcid trifluoroacètic (TFA), que no noméstrenca l'enllaç entre el pèptid i la resinaperò tambéelimina els grups protectorscom Fmoc i Boc, restaurant el pèptid al seuestat nadiu.
Mitjançant aquests passos,síntesi de pèptids-sòlids (SPPS)permet elmuntatge eficient i controlat de cadenes peptídiques sobre un suport sòlid, evitant els complicats passos de purificació intermedis necessaris en la síntesi tradicional de la-fase de solució i significativamentmillorar l'eficiència i el rendiment de la síntesi.
Mitjançant aquests passos,síntesi de pèptids-sòlids (SPPS)permet elmuntatge eficient i controlat de cadenes peptídiques sobre un suport sòlid, evitant els complicats passos de purificació intermedis necessaris en la síntesi tradicional de la-fase de solució i significativamentmillorar l'eficiència i el rendiment de la síntesi.
