Una guia per a la purificació de proteïnes recombinant d’alta qualitat: optimització de processos aigües avall i aplicacions de filtració de flux tangencial

Les proteïnes recombinants s’utilitzen àmpliament en biofarmacèutics, desenvolupament de la vacuna i diagnòstic in vitro . La seva qualitat de purificació afecta directament l’activitat, l’estabilitat i la seguretat del producte final . La purificació aigües avall és el pas crític per obtenir proteïnes d’alta puresa, proteïnes altes . filtració de flux ( Escalabilitat, cada cop s’està convertint en una eina vital en els fluxos de treball de purificació de proteïnes .

Aquest article descriu sistemàticament els passos clau en la purificació aigües avall de les proteïnes recombinants, amb un focus en les estratègies d'aplicació de la tecnologia TFF . té com a objectiu ajudar els usuaris de recerca i industrials a optimitzar els processos de purificació i millorar la qualitat de les proteïnes .

 

I . Passos del nucli en la purificació aigües avall de proteïnes recombinants

1. collita i lisi

Filtració de centrifugació/profunditat: elimina les deixalles i les impureses cel·lulars; Apte per a bacteris, llevats, etc ., Sistemes d'expressió .

Sonicació/homogeneïtzació d’alta pressió: trenca les cèl·lules per alliberar proteïnes diana; Les condicions requereixen optimització per evitar la desnaturalització de proteïnes .

Lisi enzimàtica: e . g ., tractament lisozimàtic per a bacteris; Condicions suaus però un cost més elevat .

2. Purificació primària: captura de proteïna objectiu

Cromatografia per afinitat (e . g ., his-tag, proteïna a/g): enquadernació d'alta especificitat; aconsegueix una alta puresa en un sol pas .

Cromatografia d’intercanvi d’ions (IEX): separa les proteïnes en funció de les diferències de càrrega; Apte per a la purificació en fase primerenca a mig .

Cromatografia d'interacció hidrofòbica (HIC): utilitza diferències en la hidrofobicitat de la superfície de proteïnes; Efectiu per a determinades proteïnes difícils de purificar .

3. Polishing: millora la puresa

Cromatografia d’exclusió de mida (Sec): elimina els agregats i les petites impureses de molècules; Capacitat de càrrega limitada .

Cromatografia multimodal (e . g ., capto adhere): combina diversos modes d'interacció per a una resolució superior .

4. concentració i intercanvi de buffer

Dispositius centrífugs d’ultrafiltració: adequats per a mostres a petita escala; Propens a la pèrdua de proteïnes .

Filtració de flux tangencial (TFF): eficient, escalable, ideal per a la producció industrial (detallada més tard) .

5. esterilització i emmagatzematge

0 . 22 µm filtració: elimina els microorganismes assegurant l'esterilitat.

Addició d’estabilitzadors (e . g ., glicerol, bSA): prevé la degradació de la proteïna .

 

Ii . Aplicacions clau de la filtració de flux tangencial (TFF) en la purificació aigües avall

La filtració de flux tangencial (TFF) redueix la fallada de la membrana mitjançant un flux tangencial, fent-la adequada per concentrar, desallot i buffer que intercanvien mostres de volum gran

 

1. avantatges de la tecnologia TFF

✔ Alta recuperació: minimitza les pèrdues d’adsorció de proteïnes, especialment crucials per a mostres precioses .

✔ Escalabilitat lineal: aplicable des de l'escala de laboratori (10 ml) a l'escala de producció (1000L+) .

✔ Flexibilitat del procés: un sistema únic pot realitzar concentració, diàlisi (intercanvi de buffer) i diafiltració .

 

2. TFF Cassette/Guia de selecció de membranes

Material de membrana	Característiques	Escenaris de sol·licitud
Polyethersulfone (PES)	Unió de proteïnes baixa, químicament estable (resistent al pH), flux alt	Condicions de buffer dures
Cel·lulosa regenerada (RC)	Unió de proteïnes baixes, flux alt, proteïna rutinària	Purificació de proteïnes/anticossos rutinaris

Directrius de selecció de peses moleculars (MWCO):

1/3 a 1/5 del pes molecular de la proteïna objectiu (e . g ., utilitzeu una membrana de 10 kDa per a una proteïna de 30 kDa) .

Per eliminar els agregats, trieu una mida de porus més petita (e . g ., utilitzeu una membrana de 50 kDa per a una proteïna de 100 kDa) .

 

3. Optimització dels paràmetres de funcionament TFF crítics

Pressió transmembrana (TMP): normalment de 3 a 15 psi; TMP excessivament alt promou el fouling .

El cabal tangencial: manté la turbulència per minimitzar la polarització de la concentració; Normalment 4–8 l/min · m² .

Tècniques de millora del rendiment:

Utilitzeu 2-5 volums de buffer durant la diafiltració per a Exchange complet .

Realitzeu un cop d'ull al final per recuperar la proteïna residual .

 

4. Estudi de cas típic: Purificació de l'anticòs monoclonal (MAB)

Fluid de cultiu cel·lular clarificat → proteïna A Cromatografia d’afinitat → Inactivació viral de baixa ph

 

Paper TFF:

Concentra ràpidament la proteïna diluïda A eluat a la concentració objectiu .

Intercanvia el buffer a PBS o el buffer de formulació (e . g ., Histidine Buffer) .

 

Iii . Problemes i solucions comunes

❌ Problema 1: Recuperació de proteïnes baixa

Possibles causes: adsorció de membrana; Precipitació per sobre-concentració .

Solucions: Canviar a la membrana de baix enllaç; Afegiu SURFACTANT (e . g ., 0 . 01% Tween 20).

❌ Problema 2: disminució ràpida del flux

Causes possibles: Polarització o concentració de membrana .

Solucions: Optimitzar el cabal tangencial; Implementar el ritme posterior regular; Canvieu a una estructura de membrana més oberta (e . g ., 30 kDa en lloc de 10 kDa) .

❌ Problema 3: Agregació de proteïnes

Possibles causes: força de cisalla excessiva; Buffer INSABTABLE .

Solucions: Reduir la velocitat de la bomba; Utilitzeu buffers més suaus (e . g ., que conté sacarosa o nacl) .

 

IV . resum

L’obtenció de proteïnes recombinants d’alta qualitat es basa en l’optimització dels processos de purificació aigües avall . Filtració de flux tangencial (TFF), amb la seva eficiència i escalabilitat, s’ha convertit en una eina crítica per a la concentració i l’intercanvi de tampons . mitjançant la selecció de cassets de membrana de forma racional Es pot millorar significativament, complint les demandes tant de la investigació com de la producció a escala industrial .