Aplicació deUla filtració enEextracció deNnaturalCol·lagen

 

Ⅰ.Què és el col·lagen

El col·lagen és un biopolímer, el component principal del teixit connectiu dels animals, i també la proteïna funcional més abundant i àmpliament distribuïda en mamífers, que representa entre el 25% i el 30% de la proteïna total, i fins i tot més del 80% en alguns. organismes. Té el paper d'unió del teixit a les cèl·lules animals.

Segons la mesura, un adult té uns 3 kg de col·lagen al seu cos, que està present principalment a la pell, els ossos, els ulls, les dents, els tendons, els òrgans interns (inclosos el cor, l'estómac, l'intestí i els vasos sanguinis) i altres parts. del cos humà. La seva funció és mantenir la morfologia i l'estructura de la pell i els òrgans, i també és una matèria primera important per a la reparació dels teixits danyats.

II. Extracció de col·lagen de l'escala de carpa d'herba per ultrafiltració

1. Materials i mètodes

1.1 Proves de mostres

Extracte aquós de col·lagen brut.

1.2 Mètodes de prova

1.2.1 Procés d'ultrafiltració

1.2.2 Determinació del procés de prefiltració

En aquesta prova, el procés de prefiltració òptim es determina mitjançant l'anàlisi comparativa del mètode de filtració al buit i el mètode de microfiltració. Els mètodes de prova específics són els següents:

① L'extracte aquós de col·lagen brut es filtra mitjançant un mètode de filtració al buit de paper de filtre per eliminar les partícules en suspensió i les impureses de l'extracte aquós.

② L'extracte aquós de col·lagen brut es filtra amb una membrana de microfiltració de 0,2 μm per eliminar les substàncies insolubles, les impureses, etc. de l'extracte aquós.

1.2.3 Elecció de la mida dels porus de la membrana d'ultrafiltració

Durant la purificació, la mida dels porus de la membrana d'ultrafiltració és de 100 kDa.

1.2.4 Experiment d'un sol factor del procés de purificació per ultrafiltració

L'extracte aquós de col·lagen brut es purifica mitjançant tecnologia d'ultrafiltració. Estudiar l'experiment d'un sol factor de l'efecte de la pressió de funcionament, la temperatura de funcionament i el pH sobre la retenció de col·lagen. Després d'iniciar l'equip d'ultrafiltració durant un període de temps, estudieu l'efecte de diversos factors sobre la taxa de retenció de col·lagen.

1.2.5 Fórmula de càlcul

2. Resultats i anàlisi

2.1 Anàlisi del procés de prefiltració

Consulteu la taula següent per obtenir els resultats de comparació del mètode de filtració al buit i el mètode de microfiltració.

Mètode de filtració	Concentració de la solució abans de la filtració/(g/L)	Concentració de la solució després de la filtració/(g/L)	Fenòmens sensorials
mètode de filtració al buit	0.45	0.35	La solució és clara al final de la filtració, però es torna tèrbol després de deixar-se durant un període de temps.
mètode de microfiltració	0.45	0.42	La solució és clara al final de la filtració i es manté clara després de deixar-la durant un període de temps

 

Es pot veure a la taula que tant el mètode de filtració al buit com el mètode de microfiltració poden eliminar les impureses i els sòlids insolubles de la solució, però el mètode de microfiltració té un millor efecte de protecció de les proteïnes, és a dir, la pèrdua no és significativa i el mètode de filtració al buit és susceptible de provocar pèrdues de proteïnes. A més, el filtrat està tèrbol després de col·locar-se durant un període de temps per filtració al buit, mentre que la microfiltració encara és clara i transparent, de manera que es selecciona la microfiltració com a procés de pretractament d'ultrafiltració.

2.2 Prova d'un sol factor del procés d'ultrafiltració

2.2.1 Efecte de la pressió d'ultrafiltració sobre la taxa de retenció

En condicions de temperatura 40 graus i pH 9.0, estudieu els efectes de diferents pressions d'ultrafiltració (0.07MPa, 0.{ {11}}9MPa, 0,11MPa, 0,13MPa i 0,15MPa) sobre la taxa de retenció de proteïnes. Els resultats es mostren a la figura següent.

 

Com es pot veure a la figura anterior, amb l'augment de la pressió de funcionament, la taxa d'intercepció de proteïnes va disminuir gradualment. A {{0}}.07MPa, la taxa de retenció de proteïnes és del 96,53%, quan la pressió de funcionament és de 0,15MPa, la taxa de retenció de proteïnes és del 84,38%. És perquè la separació de substàncies per ultrafiltració és impulsada per la diferència de pressió. En aquest rang de baixa pressió de funcionament, la substància molecular petita pot passar ràpidament a través de la membrana, però les substàncies macromoleculars poden quedar atrapades per la membrana d'ultrafiltració i acumular-se a la superfície de la membrana i, de moment, la superfície de la membrana i l'aigua aquosa. la diferència de concentració de la forma d'extracció provoca la resistència a la polarització de la diferència de concentració; tanmateix, amb l'augment de la pressió, la resistència a la polarització de concentració augmenta gradualment i la diferència de concentració entre la superfície de la membrana i l'extracte aquós arriba a l'equilibri. Quan la pressió supera aquest equilibri, es podria escriure una capa de gel a la superfície de la membrana (que era coherent amb la teoria de la polarització de concentració i la capa de gel formada durant la ultrafiltració). La pressió continua augmentant, augmenta el gruix de la capa de gel i augmenta la proteïna que queda a la superfície de la membrana, donant lloc a una baixa taxa de retenció. Per tal de garantir l'efecte de separació de la membrana, el paràmetre de pressió de funcionament òptim és de 0,07 MPa.

2.2.2 Efecte de la temperatura sobre la taxa de retenció de proteïnes

Sota la pressió {{0}}.11MPa, pH 9,0, estudieu els efectes de diferents temperatures (25 graus, 30 graus, 35 graus, 40 graus i 45 graus) sobre la retenció de proteïnes. Els resultats es mostren a la figura següent.

 

Com es mostra a la figura anterior, amb l'augment de la temperatura, la taxa de retenció de la membrana d'ultrafiltració augmenta gradualment i arriba al màxim a 45 graus, amb la taxa de retenció del 97,01%. Com que la viscositat del col·lagen està estretament relacionada amb la temperatura: quan la temperatura és més baixa, la viscositat del col·lagen és més gran i, per tant, el col·lagen és fàcil de formar resistència a la superfície de la membrana, donant lloc a una baixa taxa de retenció. Quan la temperatura augmenta, la viscositat del col·lagen disminueix i la interacció entre les molècules de col·lagen es debilita, de manera que augmenta la velocitat de transferència de massa i es debilita la polarització de la concentració, augmentant així la taxa de retenció. Un altre motiu de l'augment de la taxa de retenció és que la temperatura augmenta i la solubilitat del col·lagen augmenta en conseqüència i es redueix el fenomen del col·lagen que bloqueja la membrana. Per tant, la temperatura òptima per a la ultrafiltració és de 45 graus.

2.2.3 Efecte del pH sobre la retenció de proteïnes

En condicions de pressió {{0}}.11MPa i temperatura de 40 graus, estudieu els efectes de diferents condicions de pH, és a dir, pH=6.0, pH{ {5}}.{{10}}, pH=8,0, pH{=9,0 i pH{=10,0, sobre la taxa de retenció . Els resultats es mostren a la figura següent.

 

As shown in the above figure, within the pH value range of 6–7, with the increase of pH value, the protein retention rate decreases, and there is a minimum value of 82.13% at pH=7.0. When pH>7, with the increase of pH value, the retention rate gradually increases. This is because the isoelectric point of collagen pH=7, at the isoelectric point of protein is a precipitation state, easy to stay on the surface of the membrane block membrane, so that the retention rate is low; When pH>7, la taxa de retenció augmenta gradualment amb l'augment del pH. Això es deu al fet que la membrana d'ultrafiltració és una membrana d'auró de polièter amb càrrega negativa, col·lagen amb càrrega negativa en condicions alcalines, molècules de col·lagen carregades negativament i membrana d'ultrafiltració amb la mateixa càrrega formen un estat mútuament exclusiu, de manera que les molècules de col·lagen no són fàcils de mantenir a la superfície. de la membrana, no és fàcil bloquejar la membrana, de manera que el pH òptim d'ultrafiltració és 8-10.

2.3 Optimització del procés d'ultrafiltració i validació de resultats

L'anàlisi del programari Design-Expert8.05 mostra que els paràmetres òptims del procés són els següents: pressió de funcionament 0,14MPa, temperatura de funcionament 40,98 graus i pH de la solució=9,43. En aquestes condicions, la taxa de retenció era del 92,551%. Tenint en compte l'operativitat dels paràmetres reals, la pressió de funcionament és de 0,14 MPa, la temperatura de funcionament és de 40 graus i el valor de pH del líquid d'alimentació és de 9,50 en condicions d'ultrafiltració. La verificació experimental s'inicia després que el sistema del dispositiu d'ultrafiltració es comenci a ser estable. El resultat de la taxa de retenció obtinguda és (92,61 0,1)% (n=3). El valor previst de l'equació és bàsicament similar al valor mesurat, la qual cosa indica que el resultat del paràmetre condicional previst està d'acord amb el resultat condicional real.

2.4 Resultats de l'anàlisi d'electroforesi

El col·lagen purificat s'analitza mitjançant electroforesi SDS-PAGE i els resultats es mostren a la figura següent.

Com es mostra a la figura anterior, el carril 1 és el col·lagen purificat en aquest experiment i el carril 2 és la mostra estàndard de col·lagen del tendó del vedell. A partir de l'electroforesi SDS-PAGE es va poder veure que la proteïna de col·lagen proposada en aquest experiment es podria identificar com a col·lagen, però els límits aparentment indistints de la cadena peptídica a1 i la cadena peptídica a2 no estan clars. De l'electroforesi queda clar que no hi ha altres bandes de proteïnes, i es podria concloure que la puresa del col·lagen purificat és alta.